谁知道测DNA甲基化的方法？
测定亚硫酸氢盐修饰过DNA的序列是检测胞嘧啶甲基化最直接的方法.
利用PCR反应扩增修饰过的DNA，获得目的基因双链DNA.
可以对该产物直接进行序列分析。也可以通过设计甲基化特异性引物PCR，然后检测电泳条带。
当然也可以通过很多公司，例如吉泰，订购专门测定DNA甲基化的KIT，这个是最方便的。
方法概括起来可分为三类：基因组整体水平的甲基化检测、基因特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找
1) 基因组整体水平甲基化分析
a) 高效液相色谱柱（HPLC）及相关方法
b) SssI 甲基转移酶法
c) 免疫化学法
d) 氯乙醛法
2) 特异性位点的DNA甲基化的检测
a) 甲基化敏感性限制性内切酶(MS-RE)-PCR/Southern法
b) 直接测序法
c) 甲基化特异性的PCR
d) 甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(Ms-SnuPE)
e) 结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法（combined bisulfite restriction analysis，COBRA）
f) 甲基化敏感性单链构象分析
g) 甲基化敏感性变性梯度凝胶电泳
h) 甲基化敏感性解链曲线分析（methylation-specific melting curve analysis，MS-MCA）
i) 荧光法（Methylight）
j) DNA微阵列法
k) 甲基化敏感性斑点分析（methylation sensitive dot blotassay，MS-DBA）
l) 甲基化特异性多连接依赖性探针扩
3) 甲基化新位点的寻找
a) 限制性标记基因组扫描（restriction landmark genomic scanning，RLGS）
b) MBD（Methyl-CpG binding domain column chromatography，甲基化结合区）柱层析法
c) 联合甲基化敏感性限制性内切酶的MBD
一种全新的DNA甲基化研究方法——Pyrosequencing技术
DNA甲基化是一种表观遗传修饰，它是由DNA甲基转移酶（DNA methyl-transferase, Dnmt）催化S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶（mC）的一种反应，在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基。CG二核苷酸是最主要的甲基化位点，它在基因组中呈不均匀分布，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的区域，在哺乳动物中mC约占C总量的2－7％。一般说来，DNA的甲基化会抑制基因的表达。DNA的甲基化对维持染色体的结构、X染色体的失活、基因印记和肿瘤的发生发展都起重要的作用。
CpG双核苷酸在人类基因组中的分布很不均一，而在基因组的某些区段，CpG保持或高于正常概率，这些区段被称作CpG岛。CpG岛主要位于基因的启动子和第一外显子区域，约有60％以上基因的启动子含有CpG岛。 CpG甲基化的研究在肿瘤的研究中有着非常主要的地位。通过基因启动子区及附近区域CpG岛胞嘧啶的甲基化可以在转录水平调节基因的表达，从而引起相应基因沉默，去甲基化又可恢复其表达。DNA甲基化在生理情况下就参与了控制基因的时空表达，在肿瘤发生时，肿瘤细胞全基因组低甲基化是一个重要特征。肿瘤细胞基因组甲基化的程度与正常细胞相比仅为20-60% , 同时伴有局部区域基因的高甲基化,包括肿瘤抑制基因、抑制肿瘤转移和浸润的基因、细胞周期调节基因、DNA修复基因、血管形成抑制基因等。但是目前研究手段的局限，限制了DNA甲基化的广泛研究。
近年来，研究者不断探索定性及定量检测单个或多个甲基化位点的方法，但由于甲基化多态性区域存在的密度很高，所以对于延伸反应其引物的位置很难设计。Pyrosequencing技术作为一种新的序列分析技术，能够快速地检测甲基化的频率，对样品中的甲基化位点进行定性及定量检测，为甲基化研究提供了新的途径。
从原理上来看，Pyrosequencing是一种通过合成方法进行序列分析的方法，它通过核苷酸和模板结合后释放的焦磷酸引发酶级联反应，促使荧光素发光并进行检测。这项技术曾经被用作单核苷酸多态性（SNP）的基因型和单倍型的检测，以及细菌和病毒的鉴定和分型研究。这项技术的一个主要特点是在Pyrogarm™软件上显示的峰值高度来自于序列分析的原始数据，通过峰值的高度可以精确的检测混合DNA模板中等位基因的频率。
目前甲基化研究方面，很多甲基化定量分析的报道采用亚硫酸氢盐处理甲基化样本，并用混合的PCR产物
作为校正。其主要原理是：亚硫酸氢盐可以将没有甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而在适当的实验条件下甲基化的胞嘧啶保持不变。因而，用它处理样本后，再进行PCR扩增，甲基化的位点可以被当作一个C/T的SNP来处理，它的基因频率为0－100％。在此，我们给大家介绍一个研究人员使用Pyrosequencing技术分析并精确定量DNA甲基化水平的例子。
研究者在一个Pyrosequencing反应中同时检测了6个甲基化位点。这种方法同样可以用于石蜡包埋的组织，并且具有较高的重复性和精确性。实验选择谷胱甘肽-S-转移酶π（GSTP1）转录启动位点的CpG岛进行检测。这些位点在正常前列腺组织中是非甲基化的，而在肿瘤样本中高甲基化。通过PCR扩增一个包含17个甲基化多态位点140bp的片段，并用4个测序引物研究其中15个位点（Table 1）。使用在线的SNP测序引物设计软件（Pyrosequencing AB）设计测序引物，其中一些甲基化多态性位点用最可能的碱基所代替，以减少计算的数量。再通过人工检测测序引物可能存在的错配。此外，同时在PSQ 96MA DNA分析仪上运行空白对照，扣除由测序引物、生物素标记的引物或是模板引起的背景。
PCR引物设计完全与模板相匹配，不覆盖任何甲基化多态性区域。使用10ng亚硫酸氢盐转化的DNA样本或是10 fmol纯化的PCR产物，10 pmol 正向（5’-GTGATTTAGTATTGG-3’）和反向（5’-biotin-AACTCTAAACCCCATC-3’）引物扩增GSTP1转录启动位点的基因片段，扩增片段长度为144bp。反应体系为60 mM Tris-SO4, pH 8.9, 18 mM (NH4)2SO4, 1 mM MgSO4, 200 μM dNTPs，以及3 U Platinum Taq DNA高保真聚合酶，终体积为50μL。PCR循环设置：首先在95℃下变性4分钟，然后在95℃ 30S，50℃ 45S以及72℃ 20S条件下重复50个循环，最后一步延伸步骤在72℃下4分钟，中止反应。PCR反应在Eppendorf的Mastercycler 96
哺乳动物基因组中，DNA甲基化是指CpG二核苷酸中的胞嘧啶第5位碳原子被甲基化. DNA甲基化是一种基因外修饰，不改变DNA的一级结构; 他在细胞正常发育、基因表达模式以及基因组稳定性中起着至关重要的作用. 全基因组低甲基化，维持甲基化模式酶的调节失控和正常非甲基化CpG岛的高甲基化是人类肿瘤中普遍存在的现象. DNA高甲基化是导致抑癌基因失活的又一个机制.
http://www.wjgnet.com/1009-3079/abstract_cn.asp?f=1420&v=11
测定亚硫酸氢盐修饰过DNA的序列是检测胞嘧啶甲基化最直接的方法. 利用PCR反应扩增修饰过的DNA，获得目的基因双链DNA. 可以对该产物直接进行序列分析。也可以通过设计甲基化特异性引物PCR，然后检测电泳条带。
当然也可以通过很多公司，例如吉泰，订购专门测定DNA甲基化的KIT，这个是最方便的。
目前表观遗传学DNA甲基化研究测序方法常见的有：
(1)全基因组重亚硫酸盐甲基化测序[WGBS];
(2)精准DNA甲基化和羟甲基化测序[oxBS-seq];
(3)优化版简化甲基化测序[RRBS/dRRBS/XRBS];
(4)单/微量细胞全基因组甲基化测序[scWGBS];
(5)扩增子（羟）甲基化测序;
(6)（羟）甲基化DNA免疫共沉淀测序[(h)MeDIP-seq]
等6种，适用于不同DNA甲基化研究方向的解决方案。
DNA甲基化变化，是肿瘤早期变化的一个标志，肿瘤这种慢性病的产生分为多个阶段，首先人体的基因中存在着癌基因和抑制癌症的基因，在健康的身体中，癌症基因和抑制癌症的基因是一种平衡并且相互牵制的状态。当人体随年龄的增长，代谢能力的下降，或因劳累、忧虑、肥胖、过度饮酒、吸烟等原因导致身体的体质下降，这时候癌基因将会打破这种平衡关系，这一变化叫做基因的甲基化变化，甲基化变化会导致基因的序列发生变化，我们将这一过程称之为基因的突变。而基因突变后，会影响到细胞的生长和变化，变化后的非正常细胞就形成了肿块或增生组织，这就是我们通常定义的肿瘤。所以DNA甲基化检测技术可以运用于判断基因靶点是否出现甲基化表达变化，从而作为肿瘤的超早期及早期检测依据，具有较高的临床诊断学意义。以下这张图片，可了解肿瘤各阶段情况，也能直观认识到DNA甲基化的作用。
答：LUMA: 利用HpaII和MspI酶的独特特性，对CpG甲基化状态进行精细测量，但对DNA质量要求高，需配合焦磷酸测序仪。具体需求与深度分析 - 整体与位点特异性: 如果研究目标是全面了解，整体DNA甲基化检测如450K芯片是个好选择；而若需精确定位特定基因，MSP或MethyLight结合FQPCR，甚至是Bisulfite cloning & Seq...
答：DNA甲基化的检测原理主要基于两种方法：甲基化特异性酶切和甲基化特异性结合。1、甲基化特异性酶切：该方法利用DNA甲基化与未甲基化DNA的敏感性差异，通过特定的限制性内切酶进行酶切反应。未甲基化DNA序列容易被酶切，而甲基化的DNA则不易受酶切。然后，通过聚合酶链反应PCR或者核酸杂交等方法来检测酶...
答：2．亚硫酸氢盐测序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR产物...
答：b) SssI 甲基转移酶法 c) 免疫化学法 d) 氯乙醛法 2) 特异性位点的DNA甲基化的检测 a) 甲基化敏感性限制性内切酶(MS-RE)-PCR/Southern法 b) 直接测序法 c) 甲基化特异性的PCR d) 甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(Ms-SnuPE)e) 结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法（combined bisulfite restriction...
答：2、方法 利用全基因组重亚硫酸盐甲基化测序(WGBS),对这两种可互相转换的小鼠胚胎干细胞进行甲基化组学研究 3、结论 全面准确的检测了两种小鼠胚胎干细胞的DNA甲基化修饰并进行了系统的比较;同serum ESCs相比,雄性2iESCs全局低甲基化;在血清中,雌性ESCs跟雄性2i ESCs类似呈现全局低甲基化,而在2i ESCs状态下,...
答：一种全新的DNA甲基化研究方法——Pyrosequencing技术 DNA甲基化是一种表观遗传修饰，它是由DNA甲基转移酶（DNA methyl-transferase, Dnmt）催化S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶（mC）的一种反应，在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基。CG二核苷酸是最主要...
答：将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。3、高分辨率熔解曲线法（High Resolution Melting，HRM）在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物，这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化，用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的...
答：需要去专门的检测机构或者医院检查。DNA甲基化（DNA methylation）为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。所谓DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5号碳位共价键结合一个甲基基团。大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA...
答：普通的测序不能找到甲基化位点。这里有几种常用的找甲基化位点的测序方法：第一种是重亚硫酸盐测序。重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，行PCR扩增(引物设计时尽量避免有CpG，以免受甲基化因素的影响)所需片段，则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶。最后，...
答：视频12：甲基化测序 DNA的甲基化是在DNA的序列不变的条件下，在其中某些碱基上加上甲基的这样一个过程。一般是使甲基化位点的下游的基因表达量变少 甲基化和差甲化的C碱基都不能被转化成U碱基 氧化 用高钌酸钾氧化的方法来氧化羟甲基化的C，其转化效率是94%左右。用糖基把羟甲基化的C给保护起来。
