甲基化的甲基化检测方法
去哪里找最出色的生命科学学术交流论坛？>>> 方法概括起来可分为三类：基因组整体水平的甲基化检测、基因特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找。1) 基因组整体水平甲基化分析a) 高效液相色谱柱（HPLC）及相关方法b) SssI 甲基转移酶法c) 免疫化学法d) 氯乙醛法2) 特异性位点的DNA甲基化的检测a) 甲基化敏感性限制性内切酶(MS-RE)-PCR/Southern法b) 直接测序法c) 甲基化特异性的PCR（methylation-specific PCR, MS-PCR）d) 甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(Ms-SnuPE)e) 结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法（combined bisulfite restriction analysis，COBRA）f) 甲基化敏感性单链构象分析（methylation-specific single-strand conformation analysis，MS-SSCA）g) 甲基化敏感性变性梯度凝胶电泳（methylation-specific denaturing gradient gel electrophoresis，MS-DGGE）h) 甲基化敏感性解链曲线分析（methylation-specific melting curve analysis，MS-MCA）i) 荧光法（Methylight）j) DNA微阵列法k) 甲基化敏感性斑点分析（methylation sensitive dot blotassay，MS-DBA）l) 甲基化特异性多连接依赖性探针扩(Methylation-Specific multiplex ligation-dependent probe amplification，MS-MLPA)3) 甲基化新位点的寻找a) 限制性标记基因组扫描（restriction landmark genomic scanning，RLGS）b) MBD（Methyl-CpG binding domain column chromatography，甲基化结合区）柱层析法c) 联合甲基化敏感性限制性内切酶的MBD（Combination of methylated-DNA precipitation and methylation-sensitive restriction enzymes，COMPARE-MS）
曾经是2009年最值得关注的技术。遗传上除了ATGC这四种碱基，人们对第五种碱基-甲基化的胞嘧啶的兴趣也日益增加。甲基化修饰的存在对DNA转录的调控起了重要作用，异常的甲基化往往是许多疾病的起因。既然如此重要，系统绘制甲基化组的方法自然也多了起来。甲基化组（methylome）这个词还不太常见，它指的是全基因组范围内的甲基胞嘧啶。美国Salk生物研究院的Joseph Ecker及其同事刚刚通过高通量测序的方法，展现了一张人胚胎干细胞中所有甲基胞嘧啶的完整图谱。这是第一张单碱基分辨率的哺乳动物甲基化图谱，并伴随着mRNA和小RNA以及一些组蛋白修饰的比较分析。他们发现胚胎干细胞中近四分之一的甲基化是在非CG背景下，暗示胚胎干细胞采用不同的甲基化机制来影响基因调控。随着ES细胞的诱导分化，非CG甲基化消失，而在iPSC中还原。这张图谱为未来人类疾病和发育中的表观遗传学修饰研究打下了基础。美国Whitehead研究院的Meissner等也曾绘制了类似的图谱。他们利用高通量的亚硫酸氢盐测序和单分子测序，产生了覆盖大部分CpG岛的DNA甲基化图谱。他们发现，DNA甲基化模式与组蛋白甲基化模式的相关性比基因组序列更好；CpG的甲基化是动态的表观遗传标志，在细胞分化期间经历大量的改变。他们还发现，胚胎干细胞和原代细胞中与发育调控相关的“弱”CpG岛在体外增殖期间经历了异常的超甲基化，让人想起某些原发肿瘤。另外，两个独立的研究小组，分别为哈佛大学的George Church等，以及加州大学的Kun Zhang连同弗吉尼亚联邦大学的Yuan Gao等，也将传统的甲基化工具如DNA的重亚硫酸盐转化与目标基因组捕获技术和高通量测序相结合，定量测定人基因组中的甲基化。尽管这些甲基化图谱的绘制方法略有不同，但他们都采用了亚硫酸氢盐转化，将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶，并在随后的扩增步骤中转化成胸腺嘧啶。虽然很有效，但这种方法需要一些手工操作来确保完全的转化，并通过计算分析来绘制图谱。在2012年2月份，英国Oxford Nanopore Technologies的科学家提出，单分子纳米孔测序可替代这种劳动密集型的技术，测序仪能直接分辨出未修饰的胞嘧啶和甲基化胞嘧啶。当核酸外切酶消化单链DNA后，单个碱基落入孔中，它们瞬间与环式糊精相互作用，并阻碍了穿过孔中的电流。每个碱基ATGC以及甲基胞嘧啶都有自己特有的电流振幅，因此很容易转化成DNA序列。这样，纳米孔技术就能直接读出这第五种碱基。由于纳米孔测序仅限于短的寡核苷酸，因此全基因组测序还有一段很长的路要走。此外，还有一些技术障碍需要克服，比如确保碱基以正确的次序进入纳米孔，然后从另一侧离开。不过，一旦成功，第五种碱基的直接测序将会产生重大影响。
DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种DNA修饰方式在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。脊椎动物DNA的甲基化状态与生长发育调控密切相关，比如在肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。
1、甲基化特异性的PCR（Methylation-specific PCR，MSP）
用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化；反之，说明被检测的位点不存在甲基化。
2、亚硫酸氢盐测序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）
用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。
3、高分辨率熔解曲线法（High Resolution Melting，HRM）
在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物，这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化，用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中的GC含量发生改变，从而导致熔解温度的变化（图1）。
其中，样品要求：细胞（≥106 个）、组织（≥300mg）、血液（≥1ml）、血清（≥1.5ml）等样品材料，基因组DNA（体积≥20μl，浓度≥50 ng/μl）。
Septin9肿瘤基因甲基化检测技术，是由德国EIP公司（Epigenomics）研发的一项基于基因靶点是否出现甲基化表达变化的肿瘤超早期检测技术，该技术在与欧洲多家权威医疗机构进行临床试验后，获得了欧盟CE认证，在欧洲被广泛运用到肿瘤的超早期筛查和临床诊断中。之后德国EIP公司将技术授权给美国博尔诚公司（BioChain Institute Inc.）共同开发针对结直肠癌、胃癌、肝癌、食管癌、肺癌等癌症种类的检测试剂，并且与美国德州大学MD安德森癌症中心（UT MDAndersonCancerCenter）共同进行临床试验，在美获得了美国药监局FDA认证，该项技术于2016年被列入了美国疾病预防工作委员会（USPSTF）的筛查项目指南中，作为美国40岁以上人群的常规癌症超早期筛查项目之一。2014年美国博尔诚进入中国后，在北京成立博尔诚医学检验公司，与国内几十家顶级医院（北京协和、北京301、复旦大学附属肿瘤医院、四川大学华西医院、西安西京医院、中日友好医院.....）进行临床合作试验，并于2015年8月获得国家食药监局CFDA认证，目前该项目已进入到国内多家顶级三甲医院中（北京301医院、四川省人民医院、西安西京医院、中日友好医院、中南大学湘雅医院等），被运用于癌症超早期以及早期的筛查，具有重要的临床诊断学意义。
答：近年来，研究者不断探索定性及定量检测单个或多个甲基化位点的方法，但由于甲基化多态性区域存在的密度很高，所以对于延伸反应其引物的位置很难设计。Pyrosequencing技术作为一种新的序列分析技术，能够快速地检测甲基化的频率，对样品中的甲基化位点进行定性及定量检测，为甲基化研究提供了新的途径。从原理上...
答：先用中亚硫酸盐处理，使DNA中未发生甲基化得胞嘧啶脱氨基转化为尿嘧啶而甲基化的胞嘧啶保持不变，PCR扩增得到所需片段，片段中尿嘧啶全部转化成T，然后对PCR产物测序，并与未处理的序列比较，判断CpG位点是否发生甲基化。我们研究院对甲基化检测很专业，感兴趣的话，可以看看：中关村华康基因研究院 ...
答：以前这方面的甲基化研究大多基于质谱,覆盖度和研究结果有限,尚缺乏2i胚胎干细胞的甲基化组学研究。 2、方法 利用全基因组重亚硫酸盐甲基化测序(WGBS),对这两种可互相转换的小鼠胚胎干细胞进行甲基化组学研究 3、结论 全面准确的检测了两种小鼠胚胎干细胞的DNA甲基化修饰并进行了系统的比较;同serum ESCs相比,雄性...
答：DNA甲基化（DNA methylation）为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。所谓DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5号碳位共价键结合一个甲基基团。大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的...
答：近年来，研究者不断探索定性及定量检测单个或多个甲基化位点的方法，但由于甲基化多态性区域存在的密度很高，所以对于延伸反应其引物的位置很难设计。Pyrosequencing技术作为一种新的序列分析技术，能够快速地检测甲基化的频率，对样品中的甲基化位点进行定性及定量检测，为甲基化研究提供了新的途径。从原理上...
答：Bisulfite Sequencing PCR，BSP是指BSP克隆测序法。BSP实验原理：BSP克隆测序法，是目前甲基化检测的金标准。用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后再CpG岛两端设计引物进行PCR，将目的产物纯化后进行TA克隆，每个克隆挑取阳性克隆测序，最后将测...
答：Septin9是一种透过血液对结直肠癌进行检测的特殊生物标记。septin9基因甲基化是通过检查结直肠癌病人的血浆中Septin9基因的甲基化程度来检测早期癌细胞的DNA。血液Septin9甲基化检测总体灵敏度76.63%， 特异性95.93%，对不同时期结直肠癌检测灵敏度如下：1、检测I期结直肠癌灵敏度60％左右。2、检测II-...
答：HELLO，dna甲基化检测原理，DNA甲基化作用简介很多人还不知道，现在让我们一起来看看吧！1、中文名：DNA甲基化作用出处：医学遗传学（第三版）DNA甲基化作用主要是DNA甲基转移酶以S-腺苷甲硫氨酸(SAM）为甲基供体，将甲基转移至碱基特定结构上的过程。2、哺乳动物中90%的DNA甲基化修饰是由DNA甲基转移酶...
答：对于human 来说，目前主流的DNA甲基化芯片有450K 和 850K 两种，都是illumina 公司研发的。这里的450K 和 850K 指的是芯片上探针的数量，对应可以检测的甲基化位点个数。———对于亚硫酸氢盐处理的DNA ，非甲基化的C会变成T , 而甲基化的C不会变。 对于I 型探针而言，有两种序列，专业名词...
答：表观遗传学认为在不改变DNA序列的情况下，通过DNA和组蛋白的修饰来调控基因的表达，而其中DNA甲基化最为常见（DNA methylation）.在人类的表观遗传学中，CpG岛的甲基化修饰最为常见，CpG岛的甲基化修饰主要过程是在CpG甲基化结合蛋白（Methyl-CpG Binding Proteins.MBDs）和DNA甲基化转移酶（DNA ...
