甲基化检测的检测程序

去哪里找最出色的生命科学学术交流论坛？>>> 方法概括起来可分为三类：基因组整体水平的甲基化检测、基因特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找。1) 基因组整体水平甲基化分析a) 高效液相色谱柱（HPLC）及相关方法b) SssI 甲基转移酶法c) 免疫化学法d) 氯乙醛法2) 特异性位点的DNA甲基化的检测a) 甲基化敏感性限制性内切酶(MS-RE)-PCR/Southern法b) 直接测序法c) 甲基化特异性的PCR（methylation-specific PCR, MS-PCR）d) 甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(Ms-SnuPE)e) 结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法（combined bisulfite restriction analysis，COBRA）f) 甲基化敏感性单链构象分析（methylation-specific single-strand conformation analysis，MS-SSCA）g) 甲基化敏感性变性梯度凝胶电泳（methylation-specific denaturing gradient gel electrophoresis，MS-DGGE）h) 甲基化敏感性解链曲线分析（methylation-specific melting curve analysis，MS-MCA）i) 荧光法（Methylight）j) DNA微阵列法k) 甲基化敏感性斑点分析（methylation sensitive dot blotassay，MS-DBA）l) 甲基化特异性多连接依赖性探针扩(Methylation-Specific multiplex ligation-dependent probe amplification，MS-MLPA)3) 甲基化新位点的寻找a) 限制性标记基因组扫描（restriction landmark genomic scanning，RLGS）b) MBD（Methyl-CpG binding domain column chromatography，甲基化结合区）柱层析法c) 联合甲基化敏感性限制性内切酶的MBD（Combination of methylated-DNA precipitation and methylation-sensitive restriction enzymes，COMPARE-MS）

曾经是2009年最值得关注的技术。遗传上除了ATGC这四种碱基，人们对第五种碱基-甲基化的胞嘧啶的兴趣也日益增加。甲基化修饰的存在对DNA转录的调控起了重要作用，异常的甲基化往往是许多疾病的起因。既然如此重要，系统绘制甲基化组的方法自然也多了起来。甲基化组（methylome）这个词还不太常见，它指的是全基因组范围内的甲基胞嘧啶。美国Salk生物研究院的Joseph Ecker及其同事刚刚通过高通量测序的方法，展现了一张人胚胎干细胞中所有甲基胞嘧啶的完整图谱。这是第一张单碱基分辨率的哺乳动物甲基化图谱，并伴随着mRNA和小RNA以及一些组蛋白修饰的比较分析。他们发现胚胎干细胞中近四分之一的甲基化是在非CG背景下，暗示胚胎干细胞采用不同的甲基化机制来影响基因调控。随着ES细胞的诱导分化，非CG甲基化消失，而在iPSC中还原。这张图谱为未来人类疾病和发育中的表观遗传学修饰研究打下了基础。美国Whitehead研究院的Meissner等也曾绘制了类似的图谱。他们利用高通量的亚硫酸氢盐测序和单分子测序，产生了覆盖大部分CpG岛的DNA甲基化图谱。他们发现，DNA甲基化模式与组蛋白甲基化模式的相关性比基因组序列更好；CpG的甲基化是动态的表观遗传标志，在细胞分化期间经历大量的改变。他们还发现，胚胎干细胞和原代细胞中与发育调控相关的“弱”CpG岛在体外增殖期间经历了异常的超甲基化，让人想起某些原发肿瘤。另外，两个独立的研究小组，分别为哈佛大学的George Church等，以及加州大学的Kun Zhang连同弗吉尼亚联邦大学的Yuan Gao等，也将传统的甲基化工具如DNA的重亚硫酸盐转化与目标基因组捕获技术和高通量测序相结合，定量测定人基因组中的甲基化。尽管这些甲基化图谱的绘制方法略有不同，但他们都采用了亚硫酸氢盐转化，将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶，并在随后的扩增步骤中转化成胸腺嘧啶。虽然很有效，但这种方法需要一些手工操作来确保完全的转化，并通过计算分析来绘制图谱。在2012年2月份，英国Oxford Nanopore Technologies的科学家提出，单分子纳米孔测序可替代这种劳动密集型的技术，测序仪能直接分辨出未修饰的胞嘧啶和甲基化胞嘧啶。当核酸外切酶消化单链DNA后，单个碱基落入孔中，它们瞬间与环式糊精相互作用，并阻碍了穿过孔中的电流。每个碱基ATGC以及甲基胞嘧啶都有自己特有的电流振幅，因此很容易转化成DNA序列。这样，纳米孔技术就能直接读出这第五种碱基。由于纳米孔测序仅限于短的寡核苷酸，因此全基因组测序还有一段很长的路要走。此外，还有一些技术障碍需要克服，比如确保碱基以正确的次序进入纳米孔，然后从另一侧离开。不过，一旦成功，第五种碱基的直接测序将会产生重大影响。

1．甲基化特异性的PCR（Methylation-specific PCR，MSP）
用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化；反之，说明被检测的位点不存在甲基化。
2．亚硫酸氢盐测序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）
用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。
3．高分辨率熔解曲线法（High Resolution Melting，HRM）
在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物，这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化，用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中的GC含量发生改变，从而导致熔解温度的变化（图1）。