原代培养的注意事项

1. 操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。
2. 点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。
3. 操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。

原代细胞培养常见问题的原因及其解决的办法：
培养液pH值变化太快可能原因(1)CO2张力不对(2)培养瓶盖拧得太紧(3)NaHCO3缓冲系统缓冲力不足(4)培养液中盐浓度不正确(5)细菌、酵母或真菌污染建议解决方法(1)按培养液中NaHCO3浓度增加或减少培养箱内CO2浓度，2.0g/L到3.7g/L浓度NaHCO3对应CO2浓度为5%到10%。(2)松开瓶盖1/4圈。(3)改用不依赖CO2培养液。加HEPES缓冲液至10到25mM终浓度。(4)在CO2培养环境中改用基于Earle′s盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks盐配制的培养液。(5)丢弃培养物，或用抗生素除菌。
培养液出现沉淀，但pH值不变 可能原因(1)洗涤剂清洗后残留有磷酸盐，将培养基成分沉淀下来(2)冰冻保存培养液建议解决方法(1)用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后灭菌。(2)将培养液加热到37℃，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液。
培养液出现沉淀，同时pH发生变化 可能原因细菌或真菌污染建议解决方法丢弃培养物，或用抗生素除菌。
培养细胞不贴壁 可能原因(1)胰蛋白酶消化过度(2)支原体污染(3)培养瓶瓶底不干净(4)培养液pH值过碱(NaHCO3分解)(5)消化液或培养液配制错误、过期储存、储存不当
细胞老化建议解决方法(1)缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度。(2)分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物。(3)注意刷洗，或换用一次性塑料培养瓶(4)使用无菌醋酸溶液调整pH值或充入无菌CO2(将培养液敞口放入培养箱也可)(5)重新配置消化液或培养液
培养细胞生长减慢 可能原因(1)由于更换不同培养液或血清(2)培养液中一些细胞生长必需成分如谷氨酰胺或生长因子耗尽或缺乏或已被破坏。(3)培养物中有少量细菌或真菌污染(4)试剂保存不当(5)接种细胞起始浓度太低建议解决方法(1)比较新培养液与原培养液成分，比较新血清与旧血清支持细胞生长实验。让细胞逐渐适应新培养液。(2)换入新鲜配制培养液，或补加谷氨酰胺及生长因子。(3)用无抗生素培养液培养，如发现污染，丢弃培养物。或用抗生素除菌。(4)血清需保存在-5℃到-20℃。培养液需在2-8℃避光保存。含血清完全培养液在2-8℃保存，并在2周内用完。(5)增加接种细胞起始浓度
培养细胞死亡 可能原因(1)培养箱内无CO2(2)培养箱内温度波动太大(3)细胞冻存或复苏过程中损伤(4)培养液渗透压不正确(5)培养液种有毒代谢产物堆积建议解决方法(1)检测培养箱内CO2(2)检查培养箱内温度(3)取新的保存细胞种(4)检测培养液渗透压。注意：大多数哺乳动物细胞能耐受渗透压为260– 350 mOsm/kg。加入额外试剂如HEPES或药物都有可能影响培养液渗透压。(5)换入新鲜培养液

一、注意污染
1、严格进行动物皮肤消毒，使用三套器械取材。新生动物皮肤先用2%碘酒液消毒，成年鼠先用3%~5%碘酒液消毒后用75%酒精消毒。
2、严格进行无菌操作，防止细菌、霉菌、支原体污染，避免化学物质污染。
3、吸取液体前，瓶口和吸管进行火焰消毒；吸取液体时，避免瓶口和吸管碰撞。
4、离心管入台前，管口、管壁应消毒。
5、实验者离开超净台时，要随时用肘部关闭工作窗。
6、使用过的器械用酒精棉球擦去血污后，移入另一个器皿中继续消毒，在浸泡器械时剪刀口要叉开放，镊子弯头要向下放，并加盖消毒。
二、器材使用时既要注意用火焰消毒，又要防止烫伤、烫死细胞。经火焰消毒后的吸管一定要用Hanks液冷却。
三、超净台内温度、湿度较大，在夏天工作时台内散热更慢，因此进行细胞悬液混匀、接种时，离火焰要稍微远些。