PCR实验最常见的9个问题及解决方案
kuaidi.ping-jia.net 作者：佚名 更新日期：2024-07-02
1. 如何有效设计引物
（1）使用Oligo或Primer设计引物，在保守区内设计，长度一般在18-27bp，上下游引物Tm值最好是60-75℃，GC含量=40%-60%，引物自身及引物之间不应存在互补序列，避免发夹结构。
2. PCR 电泳无扩增条带
（1）酶失活或在反应体系中未加入酶。TaqDNA聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。
（2）模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成DNA脱嘌呤而影响PCR的结果。
（3）变性温度是否准确：PCR仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。
（4）反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加Taq酶以前，将反应体系95℃加热5-10分钟。
（5）引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化，或因储存条件不当而失活。
（6）引物错误。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
（7）DNA凝胶电泳时加入阳性对照，确保不是DNA凝胶和PCR程序的问题。
3. PCR 产物量过少
（1）退火温度不合适。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。
（2）DNA模板量太少。增加DNA模板量。
（3）PCR循环数不足。增加反应循环数。
（4）引物量不足。增加体系中引物含量。
（5）延伸时间太短。以1kb/分钟的原则设置延伸时间。
（6）变性时间过长。变性时间过长会导致DNA聚合酶失活。
（7）DNA模板中存在抑制剂。确保DNA模板干净
4. 扩增产物在凝胶中涂布或成片状条带弥散
（1）酶量过高。减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。
（2）dNTP浓度过高。减少dNTP的浓度。
（3）MgCl2浓度过高。可适当降低其用量。
（4）模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng，而基因组DNA则应<200ng。
（5）引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复PCR反应。
（6）循环次数过多；增加模板量减少循环次数至30，缩短退火时间及延伸时间，或改用二种温度的PCR循环。
（7）退火温度过低。
（8）电泳体系有问题：
①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；
②凝胶没有凝固好；
③琼脂糖质量差。
（9）若为PCR试剂盒则可能：
①由于运输储存不当引起试剂盒失效；
②试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。
（10）降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。
5. 扩增产物出现多条带（杂带）
（1）引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。
（2）循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。
（3）酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。
（4）退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的PCR扩增。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。
（5）样品处理不当。
（6）Mg2+浓度偏高，因适当调整Mg2+使用浓度。
（7）若为PCR试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。
（8）复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。
（9）反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。
（10）引物特异性差。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
（11）引物量过多。减少反应体系中引物的用量。
（12）模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng，而基因组DNA则应<200ng。
（13）外源DNA污染。确保操作的洁净。
6. 阴性对照出现条带
（1）试剂，枪头，工作台污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。
7. 条带大小与理论不符
（1）污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。
（2）模板或引物使用错误。查看引物是否会扩增部分条带和模板是否正确。
3)基因亚型。对研究的基因进行序列分析和BLAST研究。
8. 持续出现假性条带
（1）起始退火温度太低，或目的扩增产物和非目的产物的T值相差不大。可尝试适当提高PCR温度或者设置降落PCR，降低循环数。
9. 菌落 PCR 检测有条带，接种大摇后无条带
（1）可重新以菌落和菌液为模板进行PCR对照检测，因为菌落PCR的假阳性概率还是比较高。如果仍出现上述结果，推测可能是平板上连接液中的未连接载体的扩增引起的目的条带，进一步质粒PCR检测，可证明目的片段是否真正连接成功。
PCR实验最常见的9个问题及解决方案
答：（1）退火温度不合适。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。（2）DNA模板量太少。增加DNA模板量。（3）PCR循环数不足。增加反应循环数。（4）引物量不足。增加体系中引物含量。（5）延伸时间太短。以1kb/分钟的原则设置延伸时间。（6）变性时间过长。变性时间过长会导致DNA聚合酶失活。（7）DN...
pcr需要注意的问题
答：引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操...
关于PCR的问题??
答：1、预变性（Initial denaturation）．模板DNA完全变性对PCR能否成功至关重要，一般95℃加热3-5分钟。2、引物退火（Primer annealing）退火温度一般需要凭实验（经验）决定。退火温度对PCR的特异性有较大影响。3、引物延伸 引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。延伸时间随扩增片段长短而定。4、循环中...
请问一下PCR中的一些技巧
答：②引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有 引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条 带,此时做PCR有可能失败,应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高,一条 亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融 或长...
pcr实验注意的关键问题有哪些
答：1、设计引物：根据目标DNA片段的序列，设计一对特异性引物。引物是PCR实验的关键因素之一，好的引物可以提高扩增效率和特异性。2、准备模板：提取或制备目标DNA片段的模板。模板的质量和浓度都会对PCR实验结果产生影响。3、配置反应液：根据PCR实验的具体要求，将引物、模板、dNTPs（即dATP、dTTP、dCTP、dGTP...
荧光定量PCR的几个问题
答：1. 最好是测下浓度，把cDNA模板调整到100ng/反应再试试，PCR的循环调整到45 2. primer5 和oligo6的温度不会差很多的，两个软件都算好了，然后-3度 跑PCR 3. 做普通PCR把循环数增大到45试试，可能是你的基因的表达丰度太低了 4. 非特异性扩增不一定是引物的问题，另一个原因可能是你扩增的...
pcr的问题
答：包括：解链、退火、延伸 最重要的步骤：退火 因为退火是决定PCR特异性和效率的关键，也是唯一可以调控的步骤，解链和延伸都是由酶的性质和模版长度决定的一个固定温度和时间，而退火的温度和时间的把控则是PCR的精髓。比如Touch-down就是退火温度先高后低，适用于杂带较多；Touch-up就是退火温度先低后...
实时荧光定量PCR的个体重复问题
答：2, 4.4这四个个体同3.1, 3.3, 3.5, 3.7这四个个体来比较。如果只看均值，为3.4比3.4，无任何差别。而如果能够看到每个个体的数值，你就会剔除1这个离群值，得到前一组数值高于后一组，这个完全不同的结论。所以把几个个体混合起来做，是不能够得到正确的有效解决科学问题的实验结果的。
pcr实验室大面积污染解决办法
答：（5）设计实验对照组（根据污染源基因片段），进行阴阳对照实验，根据阴性对照确认污染情况，可采用8连排PCR管（2个阳参+6个阴参）；若阳参起跳，阴参起跳，则污染需要继续清理；若阳参起跳，阴参全部不起跳了，则说明污染等到控制，可恢复正常实验；核酸气溶胶污染清除剂（PCR Cleaner）一盒500 mL；...
PCR中怎样预防出现假阳性结果
答：1，操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2，除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。3，各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。参考资料：北京天为时代科技有限公司 PCR常见问题、原因分析及其对策 ...
（1）使用Oligo或Primer设计引物，在保守区内设计，长度一般在18-27bp，上下游引物Tm值最好是60-75℃，GC含量=40%-60%，引物自身及引物之间不应存在互补序列，避免发夹结构。
2. PCR 电泳无扩增条带
（1）酶失活或在反应体系中未加入酶。TaqDNA聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。
（2）模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成DNA脱嘌呤而影响PCR的结果。
（3）变性温度是否准确：PCR仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。
（4）反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加Taq酶以前，将反应体系95℃加热5-10分钟。
（5）引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化，或因储存条件不当而失活。
（6）引物错误。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
（7）DNA凝胶电泳时加入阳性对照，确保不是DNA凝胶和PCR程序的问题。
3. PCR 产物量过少
（1）退火温度不合适。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。
（2）DNA模板量太少。增加DNA模板量。
（3）PCR循环数不足。增加反应循环数。
（4）引物量不足。增加体系中引物含量。
（5）延伸时间太短。以1kb/分钟的原则设置延伸时间。
（6）变性时间过长。变性时间过长会导致DNA聚合酶失活。
（7）DNA模板中存在抑制剂。确保DNA模板干净
4. 扩增产物在凝胶中涂布或成片状条带弥散
（1）酶量过高。减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。
（2）dNTP浓度过高。减少dNTP的浓度。
（3）MgCl2浓度过高。可适当降低其用量。
（4）模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng，而基因组DNA则应<200ng。
（5）引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复PCR反应。
（6）循环次数过多；增加模板量减少循环次数至30，缩短退火时间及延伸时间，或改用二种温度的PCR循环。
（7）退火温度过低。
（8）电泳体系有问题：
①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；
②凝胶没有凝固好；
③琼脂糖质量差。
（9）若为PCR试剂盒则可能：
①由于运输储存不当引起试剂盒失效；
②试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。
（10）降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。
5. 扩增产物出现多条带（杂带）
（1）引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。
（2）循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。
（3）酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。
（4）退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的PCR扩增。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。
（5）样品处理不当。
（6）Mg2+浓度偏高，因适当调整Mg2+使用浓度。
（7）若为PCR试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。
（8）复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。
（9）反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。
（10）引物特异性差。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
（11）引物量过多。减少反应体系中引物的用量。
（12）模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng，而基因组DNA则应<200ng。
（13）外源DNA污染。确保操作的洁净。
6. 阴性对照出现条带
（1）试剂，枪头，工作台污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。
7. 条带大小与理论不符
（1）污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。
（2）模板或引物使用错误。查看引物是否会扩增部分条带和模板是否正确。
3)基因亚型。对研究的基因进行序列分析和BLAST研究。
8. 持续出现假性条带
（1）起始退火温度太低，或目的扩增产物和非目的产物的T值相差不大。可尝试适当提高PCR温度或者设置降落PCR，降低循环数。
9. 菌落 PCR 检测有条带，接种大摇后无条带
（1）可重新以菌落和菌液为模板进行PCR对照检测，因为菌落PCR的假阳性概率还是比较高。如果仍出现上述结果，推测可能是平板上连接液中的未连接载体的扩增引起的目的条带，进一步质粒PCR检测，可证明目的片段是否真正连接成功。
答：（1）退火温度不合适。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。（2）DNA模板量太少。增加DNA模板量。（3）PCR循环数不足。增加反应循环数。（4）引物量不足。增加体系中引物含量。（5）延伸时间太短。以1kb/分钟的原则设置延伸时间。（6）变性时间过长。变性时间过长会导致DNA聚合酶失活。（7）DN...
答：引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操...
答：1、预变性（Initial denaturation）．模板DNA完全变性对PCR能否成功至关重要，一般95℃加热3-5分钟。2、引物退火（Primer annealing）退火温度一般需要凭实验（经验）决定。退火温度对PCR的特异性有较大影响。3、引物延伸 引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。延伸时间随扩增片段长短而定。4、循环中...
答：②引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有 引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条 带,此时做PCR有可能失败,应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高,一条 亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融 或长...
答：1、设计引物：根据目标DNA片段的序列，设计一对特异性引物。引物是PCR实验的关键因素之一，好的引物可以提高扩增效率和特异性。2、准备模板：提取或制备目标DNA片段的模板。模板的质量和浓度都会对PCR实验结果产生影响。3、配置反应液：根据PCR实验的具体要求，将引物、模板、dNTPs（即dATP、dTTP、dCTP、dGTP...
答：1. 最好是测下浓度，把cDNA模板调整到100ng/反应再试试，PCR的循环调整到45 2. primer5 和oligo6的温度不会差很多的，两个软件都算好了，然后-3度 跑PCR 3. 做普通PCR把循环数增大到45试试，可能是你的基因的表达丰度太低了 4. 非特异性扩增不一定是引物的问题，另一个原因可能是你扩增的...
答：包括：解链、退火、延伸 最重要的步骤：退火 因为退火是决定PCR特异性和效率的关键，也是唯一可以调控的步骤，解链和延伸都是由酶的性质和模版长度决定的一个固定温度和时间，而退火的温度和时间的把控则是PCR的精髓。比如Touch-down就是退火温度先高后低，适用于杂带较多；Touch-up就是退火温度先低后...
答：2, 4.4这四个个体同3.1, 3.3, 3.5, 3.7这四个个体来比较。如果只看均值，为3.4比3.4，无任何差别。而如果能够看到每个个体的数值，你就会剔除1这个离群值，得到前一组数值高于后一组，这个完全不同的结论。所以把几个个体混合起来做，是不能够得到正确的有效解决科学问题的实验结果的。
答：（5）设计实验对照组（根据污染源基因片段），进行阴阳对照实验，根据阴性对照确认污染情况，可采用8连排PCR管（2个阳参+6个阴参）；若阳参起跳，阴参起跳，则污染需要继续清理；若阳参起跳，阴参全部不起跳了，则说明污染等到控制，可恢复正常实验；核酸气溶胶污染清除剂（PCR Cleaner）一盒500 mL；...
答：1，操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2，除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。3，各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。参考资料：北京天为时代科技有限公司 PCR常见问题、原因分析及其对策 ...
