PCR中怎样预防出现假阳性结果
假阳性的现象就是在空白对照出现目的扩增产物，原因是靶序列或扩增产物的交叉污染。所以，只要实验过程中注意防止交叉污染就行了。
做PCR实验主要注意以下几点：
1，操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；
2，除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。
3，各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。
高手们好。最近做酶切连接转化，最后做鉴定时，以菌落为模板进行PCR时可以见到有目的条带;当把菌落接种到LB液扩菌后，以菌液为模板进行PCR时却什么东东都没有?请问会是什么原因啊?多多指教啊!建议重新以菌落为模板进行PCR检测，再重新以菌液为模板进行PCR检测，因为菌落或者菌液PCR假阳性的几率还是比较高的。但如果还是出现以上结果，推测很可能是平板上残留的连接液中的未连接上载体的目的条带引起的，此时建议再提质粒做PCR检测和酶切检测来彻底证明你的目的片段是否真正与载体连接成功。 个人的见解希望对你有所帮助，也期望高手们批评指正!我觉得菌落PCR效果很好，虽然有假阳性的可能，但是只要是做出来，有目的条带一般是对的，你为什么还要用菌液做PCR?你还不如摇菌后提取质粒然后用质粒PCR或者酶切。既然你说到这个问题了，我觉得很有可能是你的质粒被稀释了，因为在菌落中的浓度比较大。另外也有可能是你根本就没有挑到正确的菌落来摇菌，所以就没有质粒，怎么能做出来。我觉得你做菌液的PCR和菌液的PCR必须是从单一的一个菌落挑出来的，如果不是，那肯定只有一个是正确的，我做过，只要是同一菌落不会有差错。你再试试看，祝你成功!谢谢各位高手的及时的回答。现在我都是挑单个菌落后摇菌，然后提取质粒，然后以质粒为模板做PCR，阳性的质粒再酶切进行鉴定，效果还可以。再次谢谢大家!!!第二次看到这种观点，不确定对不对，借道跟大家讨论一下，不知道lcc有没有文献支持一下这种观点?如果这种观点正确，那我以前很多关于T载体的看法就错了，所以很感兴趣。我一直以为外面的DNA片段会被大肠杆菌分泌出来的核酸酶降解。 lcc_0 wrote:推测很可能是平板上残留的连接液中的未连接上载体的目的条带引起的说来也很奇怪，以前我就是挑菌后加到LB液后摇菌，然后以菌液为模板进行PCR，再以阳性管提取质粒进行酶切鉴定，排除阴性管，这样可以少提一些质粒。最近菌液PCR总是阴性，所以就直接提质粒进行鉴定了。其中原因真的不知道是什么?我也遇到过，也许是涂抹的转化产物导致的加阳性(菌落PCR)。各位大大，我倒是碰到过菌液PCR是阴性，但是有质粒的情况，酶切也正确。一般我以为质粒抽屉和酶切鉴定是最保险的。PCR假阳性。假阴性的概率都很高。菌液的问题在于盐!盐会干扰PCR。 如果用菌液的话，可以用水洗涤离心几次，然后重悬于水，就可以了。 题外话:最近菌落PCR，阴性和阳性对照经常不扩增，而样品扩增，郁闷啊。
假阳性的现象就是在空白对照出现目的扩增产物，原因是靶序列或扩增产物的交叉污染。所以，只要实验过程中注意防止交叉污染就行了。做PCR实验主要注意以下几点：
1，操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；
2，除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。
3，各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。
考虑假阳性的来源，一个产物污染，这个是最严重的，二是样本间交叉污染，三是引物设计的不特异，针对第一种问题，建议使用UDG酶，而且一定要严格管理实验室，三个分区的物流人流是怎么样要严格执行。样本交叉污染建议样本提取过程中尽量避免使用煮沸裂解之类比较剧烈的手段，可以考虑磁珠提取，当然强阳性样本磁珠也不行，这时最好是手工磁珠提取，因为有些厂家的半自动提取仪器很扯淡，比如西安天隆，混匀很剧烈容易产生交叉污染，第三种情况就没啥可说的，换对引物，好好比对一下。当然了，说起来很简单，真要做起来非常难。
不考虑操作问题（看一楼）。
你要设计好实验，关键是引物选取。现在各大数据库有很多信息，可以blast一下。还有做菌落PCR检测，最好可以用载体上的引物
答：将UNG酶灭活,再进行扩增。这样就可以有效地防止实验室内扩增产物的污染,避免假阳性的出现。为保证PCR结果的准确性,要预防非特异性PCR扩增和污染。常用的措施是使用UNG酶。
答：将PCR确定阳性挑选出几个克隆，培养后进行提质粒，酶切，电泳鉴定是否有目标片段插入，可以避免假阳性。另外，最保险的办法就是，酶切确认过的克隆，再送去测个序，保证目标片段的序列是完全正确的。当然，也可以直接取几个单克隆去测序，看哪一个是阳性。
答：将pcr确定阳性挑选出几个克隆，培养后进行提质粒，酶切，电泳鉴定是否有目标片段插入，可以避免假阳性。另外，最保险的办法就是，酶切确认过的克隆，再送去测个序，保证目标片段的序列是完全正确的。当然，也可以直接取几个单克隆去测序，看哪一个是阳性。
答：PCR抑制物：反转录反应和PCR反应均为酶促反应，任何可能抑制这些反应的物质都会影响检验的结果。假阳性因素分析1、外源核酸污染：由于PCR的灵敏度非常高，理论上一个核酸分子的污染都有可能引起结果的假阳性，因此PCR标本采集最好使用无菌、无核酶的一次性器材，取材必须严格执行无菌操作，并小心防止混入操作...
答：PCR假阳性是指在进行多聚酶链式反应（PCR）检测时，结果显示样本中存在病原体的DNA，但实际上该样本中没有病原体或病原体的数量过低，无法引起感染。 PCR假阳性可能由多种原因造成，包括样本质量、污染、标记物的选择和PCR条件等。由于PCR检测广泛应用于许多医学领域，正确地识别PCR假阳性至关重要，以...
答：实验操作注意事项 尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因,样品间的交叉污染也是原因之一.因此,不仅要在进行扩增反应是谨慎认真,在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意：1. 戴一次性手套,若不小心溅上反应液,立即更换手套；2. 使用一次性吸头,严禁与PCR产物分析室的吸头混用,吸头不要...
答：实验操作注意事项：尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意：(1)戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套。(2)使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸...
答： 原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退火温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg2+浓度偏高6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提高退火温度4.适量用酶5.适当降低dNTP和镁离子的浓度6.减少循环次数 问题4：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：...
答：1.人员素质 要求实验室工作人员须具备分子生物学基本知识,具备分子生物学实验所需的基本操作技能,能够清醒地认识临床PCR实验操作过程中导致假阳性和假阴性的各个环节，并自觉地按照规范化程序进行操作。2.房屋设计 由于实验过程中,靶DNA可在包括空气在内的实验环境中存在，并可能污染新的试验系统, 所以在...
答：所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出 PCR 产物，而导致假阳性的产生，可用巢式 PCR 方法来减轻或消除。
