关于PCR的问题？？
1、PCR产物的电泳检测时间：一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。
2、假阴性，不出现扩增条带
模板：模板中含有杂蛋白质，模板中含有Taq酶抑制剂，模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增。
对策为：选定一个好的引物合成单位。引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
3、假阳性
出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
4、出现非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。
其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。
5、出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。
参考资料来源：百度百科-PCR扩增
"子链合成方向是从5'-3'",这句话说得很清楚，就是子链。
任何DNA链的延长方向都是从5'向3'，因为需要3'羟基做引物，新的底物dNTP一个一个向上加，都留下自由的3'羟基，所以是从5'向3'延伸。也就是从模板的3'端向5'延伸。
模板DNA完全变性对PCR能否成功至关重要，一般95℃加热3-5分钟。
2、引物退火（Primer annealing）
退火温度一般需要凭实验（经验）决定。
退火温度对PCR的特异性有较大影响。
3、引物延伸
引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。
延伸时间随扩增片段长短而定。
4、循环中的变性步骤
循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性：
变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。
5、循环数
大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特异扩增。
6、最后延伸
在最后一个循环后，反应在72℃维持
可见94度左右应该是在这个温度能使各种靶DNA序列完全变性，这是生物学家已经研究的理论成果，72度是Taq酶最适温度，只有在这个温度下，该酶的活性才能达到最大！
答：其主要问题是引物结合位点的特异性问题。为了解决这个问题，可以采用限制性内切酶进行精准切割，以保证只扩增特定的DNA序列。此外，也可以使用人工合成的引物，以确保特异性结合。同时，使用高保真的DNA聚合酶也是提高PCR准确性的重要手段。这些方法结合使用，可以有效解决PCR问题。
答：这说明三种情况：1.你的前两对引物的特异性足够好，而第三对引物在设计方面有缺陷，导致对第三种基因扩增的时候特异性不够好，扩增不出来。2. 你说你这三种引物的PCR过程都是一样的，那么有可能你所使用的PCR体系对1,2对引物都是适用的，但是对第3对则不适用。需要微调一下。3.第三对引物没有...
答：原因有PCR体系问题、引物问题、模板质量问题。1、PCR体系问题：检查PCR体系有没有问题，也就是试剂有没有问题，比如扩其他的基因能不能扩出来。2、引物问题：其他基因能扩出来，就要考虑引物有没有问题，根据引物特征优化扩增条件，片段是不是太大，序列有没有特殊性。3、模板质量问题：考虑模板质量有没...
答：首先，在设计PCR引物时，结构要好，长度应在20bp左右，避免引物间形成引物二聚体。两条引物的退火温度尽量保持一致，最好是在55度左右。其次，使用的DNA模板量是比较关键的，应使用纯度较高，基因组较完全，没有产生断链的基因组DNA。然后是PCR体系中各个试剂的使用，比如说酶的纯度，活性，并且要注意...
答：1. 最好是测下浓度，把cDNA模板调整到100ng/反应再试试，PCR的循环调整到45 2. primer5 和oligo6的温度不会差很多的，两个软件都算好了，然后-3度 跑PCR 3. 做普通PCR把循环数增大到45试试，可能是你的基因的表达丰度太低了 4. 非特异性扩增不一定是引物的问题，另一个原因可能是你扩增的...
答：2、引物设计问题：PCR引物的序列和浓度会影响PCR反应的特异性和产物长度。使用经过验证的引物序列，并尝试调整引物浓度。3、模板DNA质量问题：模板DNA质量会影响PCR反应的特异性和效率，进而影响产物长度。使用高质量的模板DNA。4、DNA片段长度多态性：样品中存在多态的DNA片段长度时，会出现PCR产物长度不同...
答：如果条带不够亮，还有拖尾、非特异条带、引物二聚体等问题，那就是你反应体系中需要优化。1、出现非特异扩增可能是你的引物设计上特异性差或者引物浓度,
答：PCR没有产物，首先确定加样是否准确，且各个试剂是否有降解或失效，如果均正确有可能是程序设置方面出现问题或退火温度过高。PCR产物呈片状应该是退火温度偏低，出现了较多的非特异条带，可适当提高退火温度。
答：1.提取细胞的RNA时，可以将细胞加入EP管，离心后去上清液，再加Trizol吗？——可以。2.细胞或组织提取RNA时，加入Trizol 后是否可以放入-80度冰箱保存。——可以。3.多种肿瘤细胞做定量PCR测某个基因的表达的对比时，要不要再做琼脂糖凝胶电泳了？——不用。4.细胞生长曲线测定（测8天），使用MTT...
答：3 直接提取的真核DNA做PCR，得到的是完整的DNA产物。至于你问怎么得到目的基因，我不太能理解。首先你要知道你的目的基因是什么，你的目的基因是真核生物的完整DNA，就用DNA做PCR；目的基因是cDNA就用cDNA做PCR。弄清PCR过程，原理，和一些名词，再看你的问题，你会发现根本不是问题。没懂发站内信...
