荧光定量PCR的几个问题
应该是用每个样本算出的基因表达的相对量来做统计分析。用2-delter delter值也不能说错，不过感觉很怪。简单的组间分析，用不着用SPSS吧。Excel就全部搞定了。
你应该是做三次实验，至于每次试验重复几次完全取决于你自己。如果样本加样，PCR反应的误差很大，建议多重复几次。不然2次就完全够了。主要是看有无系统误差。我的那个文章要的人很多，我发到百度文库了。就不再一一发email了。
1.按照正确的开关机顺序操作,有助于延长仪器的使用寿命,减少仪器出故障的频率.开机顺序：先开电脑,待电脑完全启动后再开启定量PCR仪主机,等主机面板上的绿灯亮后即可打开定量PCR的收集软件,进行实验.关机顺序：确认实验已经结束后,首先关闭信号收集软件,然后关掉定量PCR仪主机的电源,最后关闭电脑.
2.应该定期备份您的实验数据,备份频率推荐每周一次,用光盘刻录.同时您也应该备份定量PCR仪的各种纯荧光光谱校正文件、背景文件和安装验证实验数据,这些文件所在的目录是C：/Appliedbiosystems/SDS Document.
3.良好的实验室环境有助于延长仪器的使用寿命,减少仪器出故障的频率.推荐做到以下几个方面：
电源：推荐配备合适的UPS或稳压器.
通风：仪器的通风应该没有阻挡.
温度：推荐实验室配备空调,温度应该控制在10-30°C之间.
湿度：20-80%；对于潮湿的省份,推荐实验室配备除湿机.
空间：易于操作,安全.
4.怎样判断定量PCR仪的样本加热块是否被污染?怎样清除污染
一个办法是运行背景校正反应板,当一个或多个反应孔连续显示出不正常的高信号,则表明该孔可能被荧光污染物.另外一种办法是在不放任何物品到样本块上的前提下,执行ROI的校正,当某个孔的信号明显高出其他孔时,则表明该孔被污染.
清除样本加热块污染的步骤如下：用移液器吸取少量乙醇并滴入每个污染的反应孔中.吹打数次.将废液吸入废液杯中.重复以上步骤：乙醇三次,去离子水三次.确认反应孔中的残留液体蒸发完.
2. primer5 和oligo6的温度不会差很多的，两个软件都算好了，然后-3度 跑PCR
3. 做普通PCR把循环数增大到45试试，可能是你的基因的表达丰度太低了
4. 非特异性扩增不一定是引物的问题，另一个原因可能是你扩增的基因同源基因比较多，或者你设计的引物刚好在保守的domain区域，这样的情况即便引物再好，也很容易能扩增出来其他的东西。
最后，不要心急，遇到问题一个一个解决，荧光定量做起来不是很难，但是还是需要一些经验，
答：溶解曲线不止一个主峰1、引物设计不佳：避免二聚体和发夹结构的出现；2、引物浓度不佳：适当调整引物浓度；3、退火温度低：提高退火温度；4、镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度；5、模板中有基因组的污染：通过引物设计避免非特异扩增。
答：给楼主点建议 扩增效率理论上不可能超过2.计算值超过2,可能是因为PCR效率不高或者不稳定,结果线性度差,导致某个区间的数据点计算出来的扩增效率反而大于2.这样的标准曲线如果作图的话,数据点都不在一条直线上.一般都是试剂扩增效率有问题,离子浓度不对,或者酶比较劣质.也有可能是引物不好.可以先换一对...
答：做了一个实验，内部参考电压可以得到几个CT值，会得到多个目标基因。在这种情况下，根据CT值的平均值，将得到的比率（相对量）。实验肯定不是唯一的一次，至少重复3次。这将是一个倍数的3个或更多，得到。 3个以上的值，你可以计算平均值和标准偏差的。
答：你盖紧了盖子不等于就盖紧了PCR管。可能你用的是国产的PCR管吧。通常国产的质量稍差，本身就是密封不严的。也就是说PCR管口不够严密，盖上PCR管子的盖，也不能完全密封。这样即使你怎么使劲盖，也没有用。要解决蒸发的问题，有两个办法，一个是用进口管，可以有效的减少蒸发，但如果你体系做得太...
答：1、如果有标准曲线，按照标准曲线计算；2、一般都是相对量，则用deltadeltaCT方法来计算；3、引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性；4、模板量不足：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起；5、看CT值是分析荧光定量PCR最直观的一个数据，CT值一般在35左右就失去参考价值了，平时我们...
答：既然溶解曲线都只有一个峰（要确定前面没有小峰），那么引物特异性还可以。标准曲线的点都不在线上说明标准曲线做的不好，如果能确定PCR反应体系是很好的，那么可能由于样品稀释的问题。建议采用极限稀释法，保证10倍、10倍之间非常准确！希望能帮到你！
答：看这个结果有几个猜想：1)如果之前做实验的时候，仪器没有出现过这种情况，有可能是仪器出现错误，建议重启一下，或者改软件需要重新校准一下。2)从这个结果来看，引物应该是可以用的，主峰也只有一个，特异性还是有的，不过还要参考一下扩增曲线，Ct值如果在35个循环以内，应该是没有问题的。
答：荧光定量pcr大片段会产生强烈干扰，定量PCR扩增片段小于250bp，不能超过400。荧光定量PCR产物长度最好不要超过300bp，产物越长一次循环激发的荧光就越多，达到荧光阈值需要的循环数就越少，会使得CT值出现过晚，一般采用80-150bp的产物长度，荧光定量pcr大片段会产生强烈干扰，定量PCR扩增片段小于250bp。
答：二者结果相同。都能说明生物体外的特殊DNA复制的整个过程的扩增效率和溶解温度情况。区别：1、二者系统组成不同 荧光定量PCR仪比普通的PCR仪多了荧光信号采集系统和计算机分析处理系统。2、二者原理不同 荧光定量PCR实时监测与DNA结合的荧光染料激发的荧光，普通OCR通过检测插入DNA中核算染料的量来测定PCR最终...
答：9. 3’端不要以A结尾，3′端不可修饰，而且要避开AT,GC rich的区域，避开T/C,A/G连续结构（2-3个）。10. 引物3′端要避开密码子的第3位。11.引物整体设计自由能分布5‘端大于3’端，且3‘端自由能最好小于9KJ/mol。可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况。12.做荧光定量产物长度80-150...
