DNA或RNA样品不纯,用紫外分光光度计测定其浓度和纯度的准确性会受到影响,为什么?
kuaidi.ping-jia.net 作者：佚名 更新日期：2024-07-12
如何利用分光光度计测量dna样品的浓度和纯度？还有其他方法？他们之间有什么区别？
分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。核酸在波长 260 nm处有最高吸收峰。吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质，不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性。但紫外法不能区分DNA和RNA，只能用来鉴定核酸的纯度和含量。
蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处，在260nm处的吸收值公为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。RNA的260nm与280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的260nm与280nm吸收的比值则在1.9左右。当样品中蛋白质含量较高时比值即下降。
分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。
核酸的定量
DNA和RNA都有吸收紫外光的性质，它们的吸收高峰在260nm波长处，每种核酸的分子构成不一， 因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如：1OD 的吸光值分别相当于50μg / ml 的dsDNA，37μg / ml 的ssDNA， 40μg/ml的RNA，30μg/ml的寡核苷酸。测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度，这些由分光光度计内预设的程序执行，因此，测试前选择正确的程序，测试样品的类型，首先测试空白液，然后再测试样品，注意输入样品稀释倍数。
如何避免吸光值漂移
读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器， 表现出的吸光值漂移越大。事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，允许吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度。
核酸本身物化性质
溶解核酸的缓冲液的pH 值、离子浓度等
在测试时，离子浓度太高也会导致读数漂移，因此建议使用pH 值一定、离子浓度较低的缓冲液（如TE）可大大稳定读数。核酸的吸光值受pH值和缓冲液离子浓度影响。只有在一定的pH值和低离子浓度的条件下（如10 mM Tris-HCl pH 8.0），才能得到精确的检测结果。水的pH值不稳定，可能导致检测误差。一些缓冲液在紫外范围内存在自身吸收，为了确保准确测量，请使用与悬浮或洗脱样品时相同的缓冲液。
样品的稀释浓度
同样是不可忽视的因素，由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A ，吸光值最好在0.1-1.5 A。在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。
操作因素
如混合要充分，否则吸光值太低， 甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。
各波长具体含义及相关问题1. A260nm
是核酸最高吸收峰的吸收波长，最佳测量值的范围为0.1至1.0。如果不在此范围，稀释或浓缩样品，使之在此范围内；如果吸光度小于0.05，检查是否存在操作因素（如移液不准确，样品内有悬浮物等）影响。DNA样品的A260 吸光度值是否>0.1。（请注意，这个值跟仪器无关，核酸的吸光度必需大于0.1，其值才有效和可靠，因为样品中的杂质和颗粒这些不纯物的干扰通常会对光有一定吸收，其值<0.1）；
朗伯－比尔定律：
A 吸光值
I0 入射光强度
I 投射光强度
c 吸光物质的摩尔浓度（mol/L）
d 光通过的液层厚度（cm）
ε 摩尔吸光系数（Lmol-1cm-1）
2. A280nm
是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA的A260/A280比值为1.8，纯RNA为2.0。如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚类物质的污染，需要纯化样品。比值=1.5相当于50％蛋白质/DNA溶液
3. A230nm
是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA和 RNA的A260/A230比值为2.5。若比值小于2.0标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。A230产生负值主要是由于在很低DNA 浓度的溶液中的一些其他成分的干扰所导致的。在下一个测定中，需要降低样品的稀释度，A230的负值会被校正。
4. A320nm或A340nm
为检测溶液样品的浊度和其他干扰因子。该值应该接近0.0。如果不是，标明溶液中有悬浮物，需要纯化样品。纯样品的A320一般是 0。
5. A260/A280和A260/A230
是核酸纯度的指示值，纯度好的DNA，在pH7-8.5 下其比值应该在2.0 或2.5，A260 / A280的比值， 用于评估样品的纯度， 因为蛋白的吸收峰是280 nm。 纯净的样品比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。
A230是多肽、芳香基团、苯酚和一些碳氢化合物的吸光度，A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物、多肽、苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0 。A280是蛋白质的吸光度。
利用紫外分光光度计测得DNA或RNA浓度的结果比实际浓度一般 是偏高还 ...
答：现在利用紫外分光光度仪测出来的DNA和RNA的浓度应该是比较准的了，利用琼脂糖凝胶电泳检测后也可以对dna和RNA的浓度进行定量分析，但是比较费时间，有条件的实验室都开始用紫外分光光度仪测DNA和RNA的浓度了。望采纳
如何用紫外分光光度计测DNA浓度
答：A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品，A320一般是0。分光光度计的重要配件—— 比色杯 比色杯按照材质大致分为石英杯、玻璃杯以及塑料杯。根据不同的测量体积，有比色杯和毛细比色杯等。一般测试核酸和紫外定量蛋白，均采用石英杯或者玻璃杯，但是不适合比色法测定。因为反应中的染料（如考马...
DNA与RNA鉴别与提取是所需要用到的试剂
答：常规的鉴定包括：1. 凝胶电泳鉴定DNA或RNA大小是否正确，样品是否有降解等；需要的试剂包括琼脂糖，EB或其他核酸染料，DNA/RNA Marker。当然还需要配套的仪器。2. 紫外分光光度计检测DNA或RNA的浓度和纯度；这个不需要特别的试剂，但需要紫外分光光度计，一般检测OD260与OD280的吸光值。
核酸是怎样被吸收的呢?
答：在230nm处为吸收低谷，RNA钠盐的吸收曲线与DNA无明显区别。不同核苷酸有不同的吸收特性。所以可以用紫外分光光度计加以定量及定性测定。实验室中最常用的是定量测定小量的DNA或RNA。对待测样品是否纯品可用紫外分光光度计读出260nm与280nm的OD值，因为蛋白质的最大吸收在280nm处，因此从A260/A280的...
用紫外分光光度法测定核酸的缺点有哪些
答：浓度为1μg/mL 的 DNA 溶液其光密度为0.020,而浓度为1μg/mL 的RNA 溶液其光密度为0.024.因此,测定未知浓度的DNA （RNA）溶液的光密度OD260nm,即可计算测出其中核酸的含量.该法简单、快速、灵敏度高,如核酸3μg／mL 的含量即可测出.对于含有微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质的核酸样品,测定...
紫外分光光度计测量DNA在260和280纳米的吸光度的意义及区别?
答：DNA的碳环结构使它在OD260处有特异吸收，对标准样品来说，浓度为1μg / ml时，当OD260＝1时， dsDNA浓度约为50μg / ml ssDNA浓度约为37μg / ml RNA浓度约为40μg / ml 经验值：纯DNA：OD260/OD280≈1.8(＞1.9,表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染）纯RNA：1.7 ...
请问,用RNA 检测融合有哪些需要考虑的质控参数?怎样保障检测的准确性...
答：RIN值是基于18S和28S rRNA电泳图分区计算得出的RNA降解程度，范围是0-10，数值越高说明RNA完整性越好。反映RNA完整性的另一参数是DV200，即超过200个核苷酸的RNA片段的百分比，阈值通常为30%。对于RNA纯度的评估，可以通过紫外分光光度法检测样品吸光值A260/A280及A260/A230的比值反映RNA纯度，纯RNA...
DNA含量的测定方法
答：那要看你用什么方法测定DNA和RNA：（1）紫外吸收法也就是测量OD（260）和OD（280）的吸收值，这样的方法其它的杂质对测量结果影响大一点，因为其它杂质在这两个吸收波长也有吸收。（2）荧光法，用PicoGreen荧光染料，测定DNA，RNA浓度比较灵敏，并且适合测量低浓度和微量DNA和RNA，并且受其它杂质的影响不...
怎么用可见紫外分光光度计测定样品?
答：第三部把标准溶液放入样品室，依次测量他们的吸光度，仪器一般会自动记录之后就会给出标准曲线方程，实验完毕。如果仪器不能直接记录吸光度，可以先记在笔记本上，之后用excel软件进行计算标准曲线。判断做出的标准曲线是否能用，看哪个R值即那个相关系数，一般最少做出0.999就可以用了，差一点的仪器也可以...
如何证明提取到的核酸是DNA还是RNA?如果证明该核酸是DNA,那么怎么确定DN...
答：取出少量样品 用特异性酶切，检查大分子是否还在（uv 或者 电泳），确认。用紫外分光光度计 扫描，计算A260/A280之比值，如果大于1.8 说明RNA污染，如果小于1.8 有蛋白污染。（原理这里不讲了 太费时间）
取1μDNA，用ddH2O水稀释到1ml，以1ml ddH2O为对照，紫外分光光度计测定OD260，OD280，OD260/OD280(都在 1.8左右之间，说明 DNA样品纯度较高),concentration。
另，基因组DNA1％的琼脂糖凝胶电泳检测均呈现完整清晰条带没有拖尾，说明 DNA 样品的完整性好，也可通过DNA marker 推算出DNA浓度。
两种方法各有优劣。
电泳法
更直观，如果你有DNA
Maker，并且知道Maker的浓度，就可以使用一维条带
分析软件
如Quantity
One分析样品中DNA的含量，而且可以很直观地了解目的DNA的纯度、大小等特性。
但是，由于电泳中染色特异性很强，对DNA、RNA之外的小分子污染情况无法检测。
紫外法可对样品中所有具
紫外吸收
特性的物质给出一个综合的结果。因此如果样品中有其他影响DNA后续操作的物质，样品吸光值就会有很大偏移。
值得注意的是，紫外法仅可作为一个参考，吸光值是结果，而不是原因。吸光值符合要求并不能代表DNA纯度符合要求。一般紫外分析后还是要跑个电泳，两者结合就可靠多了。
分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。核酸在波长 260 nm处有最高吸收峰。吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质，不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性。但紫外法不能区分DNA和RNA，只能用来鉴定核酸的纯度和含量。
蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处，在260nm处的吸收值公为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。RNA的260nm与280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的260nm与280nm吸收的比值则在1.9左右。当样品中蛋白质含量较高时比值即下降。
分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。
核酸的定量
DNA和RNA都有吸收紫外光的性质，它们的吸收高峰在260nm波长处，每种核酸的分子构成不一， 因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如：1OD 的吸光值分别相当于50μg / ml 的dsDNA，37μg / ml 的ssDNA， 40μg/ml的RNA，30μg/ml的寡核苷酸。测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度，这些由分光光度计内预设的程序执行，因此，测试前选择正确的程序，测试样品的类型，首先测试空白液，然后再测试样品，注意输入样品稀释倍数。
如何避免吸光值漂移
读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器， 表现出的吸光值漂移越大。事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，允许吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度。
核酸本身物化性质
溶解核酸的缓冲液的pH 值、离子浓度等
在测试时，离子浓度太高也会导致读数漂移，因此建议使用pH 值一定、离子浓度较低的缓冲液（如TE）可大大稳定读数。核酸的吸光值受pH值和缓冲液离子浓度影响。只有在一定的pH值和低离子浓度的条件下（如10 mM Tris-HCl pH 8.0），才能得到精确的检测结果。水的pH值不稳定，可能导致检测误差。一些缓冲液在紫外范围内存在自身吸收，为了确保准确测量，请使用与悬浮或洗脱样品时相同的缓冲液。
样品的稀释浓度
同样是不可忽视的因素，由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A ，吸光值最好在0.1-1.5 A。在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。
操作因素
如混合要充分，否则吸光值太低， 甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。
各波长具体含义及相关问题1. A260nm
是核酸最高吸收峰的吸收波长，最佳测量值的范围为0.1至1.0。如果不在此范围，稀释或浓缩样品，使之在此范围内；如果吸光度小于0.05，检查是否存在操作因素（如移液不准确，样品内有悬浮物等）影响。DNA样品的A260 吸光度值是否>0.1。（请注意，这个值跟仪器无关，核酸的吸光度必需大于0.1，其值才有效和可靠，因为样品中的杂质和颗粒这些不纯物的干扰通常会对光有一定吸收，其值<0.1）；
朗伯－比尔定律：
A 吸光值
I0 入射光强度
I 投射光强度
c 吸光物质的摩尔浓度（mol/L）
d 光通过的液层厚度（cm）
ε 摩尔吸光系数（Lmol-1cm-1）
2. A280nm
是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA的A260/A280比值为1.8，纯RNA为2.0。如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚类物质的污染，需要纯化样品。比值=1.5相当于50％蛋白质/DNA溶液
3. A230nm
是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA和 RNA的A260/A230比值为2.5。若比值小于2.0标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。A230产生负值主要是由于在很低DNA 浓度的溶液中的一些其他成分的干扰所导致的。在下一个测定中，需要降低样品的稀释度，A230的负值会被校正。
4. A320nm或A340nm
为检测溶液样品的浊度和其他干扰因子。该值应该接近0.0。如果不是，标明溶液中有悬浮物，需要纯化样品。纯样品的A320一般是 0。
5. A260/A280和A260/A230
是核酸纯度的指示值，纯度好的DNA，在pH7-8.5 下其比值应该在2.0 或2.5，A260 / A280的比值， 用于评估样品的纯度， 因为蛋白的吸收峰是280 nm。 纯净的样品比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。
A230是多肽、芳香基团、苯酚和一些碳氢化合物的吸光度，A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物、多肽、苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0 。A280是蛋白质的吸光度。
答：现在利用紫外分光光度仪测出来的DNA和RNA的浓度应该是比较准的了，利用琼脂糖凝胶电泳检测后也可以对dna和RNA的浓度进行定量分析，但是比较费时间，有条件的实验室都开始用紫外分光光度仪测DNA和RNA的浓度了。望采纳
答：A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品，A320一般是0。分光光度计的重要配件—— 比色杯 比色杯按照材质大致分为石英杯、玻璃杯以及塑料杯。根据不同的测量体积，有比色杯和毛细比色杯等。一般测试核酸和紫外定量蛋白，均采用石英杯或者玻璃杯，但是不适合比色法测定。因为反应中的染料（如考马...
答：常规的鉴定包括：1. 凝胶电泳鉴定DNA或RNA大小是否正确，样品是否有降解等；需要的试剂包括琼脂糖，EB或其他核酸染料，DNA/RNA Marker。当然还需要配套的仪器。2. 紫外分光光度计检测DNA或RNA的浓度和纯度；这个不需要特别的试剂，但需要紫外分光光度计，一般检测OD260与OD280的吸光值。
答：在230nm处为吸收低谷，RNA钠盐的吸收曲线与DNA无明显区别。不同核苷酸有不同的吸收特性。所以可以用紫外分光光度计加以定量及定性测定。实验室中最常用的是定量测定小量的DNA或RNA。对待测样品是否纯品可用紫外分光光度计读出260nm与280nm的OD值，因为蛋白质的最大吸收在280nm处，因此从A260/A280的...
答：浓度为1μg/mL 的 DNA 溶液其光密度为0.020,而浓度为1μg/mL 的RNA 溶液其光密度为0.024.因此,测定未知浓度的DNA （RNA）溶液的光密度OD260nm,即可计算测出其中核酸的含量.该法简单、快速、灵敏度高,如核酸3μg／mL 的含量即可测出.对于含有微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质的核酸样品,测定...
答：DNA的碳环结构使它在OD260处有特异吸收，对标准样品来说，浓度为1μg / ml时，当OD260＝1时， dsDNA浓度约为50μg / ml ssDNA浓度约为37μg / ml RNA浓度约为40μg / ml 经验值：纯DNA：OD260/OD280≈1.8(＞1.9,表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染）纯RNA：1.7 ...
答：RIN值是基于18S和28S rRNA电泳图分区计算得出的RNA降解程度，范围是0-10，数值越高说明RNA完整性越好。反映RNA完整性的另一参数是DV200，即超过200个核苷酸的RNA片段的百分比，阈值通常为30%。对于RNA纯度的评估，可以通过紫外分光光度法检测样品吸光值A260/A280及A260/A230的比值反映RNA纯度，纯RNA...
答：那要看你用什么方法测定DNA和RNA：（1）紫外吸收法也就是测量OD（260）和OD（280）的吸收值，这样的方法其它的杂质对测量结果影响大一点，因为其它杂质在这两个吸收波长也有吸收。（2）荧光法，用PicoGreen荧光染料，测定DNA，RNA浓度比较灵敏，并且适合测量低浓度和微量DNA和RNA，并且受其它杂质的影响不...
答：第三部把标准溶液放入样品室，依次测量他们的吸光度，仪器一般会自动记录之后就会给出标准曲线方程，实验完毕。如果仪器不能直接记录吸光度，可以先记在笔记本上，之后用excel软件进行计算标准曲线。判断做出的标准曲线是否能用，看哪个R值即那个相关系数，一般最少做出0.999就可以用了，差一点的仪器也可以...
答：取出少量样品 用特异性酶切，检查大分子是否还在（uv 或者 电泳），确认。用紫外分光光度计 扫描，计算A260/A280之比值，如果大于1.8 说明RNA污染，如果小于1.8 有蛋白污染。（原理这里不讲了 太费时间）
