细胞复苏步骤和注意事项
一、细胞复苏
将冻存细胞从液氮中取出后，在37℃水浴锅内不断摇动促进其融化。移人15ml离心管中，加入10ml预热的DMEM完全培养基，轻轻吹匀，离心，2000rpmX2min，弃上清液。
加入10ml DMEM培养基清洗，弃上清液。加入10ml DMEM完全培养基，轻轻吹打，接种于10cm盘中，在含5%CO2的细胞培养箱中培养。
二、细胞传代
细胞密度达到80%~90%时．去培养基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0．25%EDTA的胰蛋白酶，放人细胞培养箱3min。加人1ml DMEM完全培养基终止胰酶消化，转移至15ml离心管。
加入10ml PBS清洗细胞培养盘，转移至15ml离心管，2000rpmX2min，弃上清液。再加入10ml PBS（经高压灭菌，保存于40C），吹匀，吸取10微升进行计数，按照1×106/盘接种，在含5%CO2的细胞培养箱继续培养。
三、细胞冻存
细胞密度达到80%～90%时，去培养基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶，放人细胞培养箱3min。加入lmlDMEM完全培养基终止胰酶消化，转移至15ml离心管。加入10ml PBS清洗细胞培养盘，转移至15ml离心管，2000rpmX2min，弃上清液。
加入lml冻存液（90%血清，10%DMSO），放入冻存盒内（盒内有异丙醇，以保证温度降低的速度），立即放入一80℃冰箱内，过夜，第二天放入液氮中，可以保存至少两年，如不放人液氮，可以保存三个月。
冻存液的配制：70%的完全培养基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。
注意事项
（1）进入细胞间开始细胞培养时，必须严格按照下列步骤操作：
①确定所有的细胞操作用的溶液和耗材都已经消毒并检测没有问题，不确定的溶液和耗材请勿使用，除非特殊情况，不要借用别人的溶液。
②确定衣服的袖口已经卷起或者白大褂的袖口已经扎紧。
③确定酒精灯内的酒精量，需要的话及时进行补充。
④确定所有需要用到的溶液和耗材都放在伸手可及的位置。为了方便单手开启瓶盖，实验开始前可以把所有瓶盖旋松。
⑤尽量不要直接倾倒溶液，除非瓶口没有被烧坏。如果倾倒失败，溶液粘在瓶口，请用喷过75%酒精的纸巾仔细清洁瓶口周围（不要接触到瓶口）后在火焰上简单烧灼。
⑥操作时如果不能肯定所用的耗材是洁净的，必须及时更换。
⑦实验完毕及时收拾，保持工作区域清洁整齐，最后用75%酒精清洁台面。
（2）细胞污染的预防
①实验用品防止污染。细胞培养所用试剂、耗材、器材的清洗、消毒要彻底，各种溶液灭菌要仔细，并在无菌实验检测阴性后才能使用。操作室及剩余的无菌器材要定期清洁、消毒、灭菌。
②操作过程防止污染。
③穿着容易起静电或吸附灰尘的衣物必须更换为白大褂后才能进入细胞间。
④实验开始前需要确定戴的手套没有问题，只要接触过生物安全柜之外的物品，必须及时对手套进行消毒。
⑤进入细胞培养间后关好门，坐下来尽量少走动以免影响生物安全柜的风帘。工作开始前要先用75%酒精棉球擦手和瓶盖。事先要严格检查所用的器材、溶液和细胞，不要把污染品或未经消毒的物品带入无菌室内，更不能随便使用，以免造成大规模污染。
⑥细胞操作时动作要轻，必须在火焰周围无菌区内打开瓶口，并将瓶口放在火焰周围简单转动烧灼，注意不要让火焰把塑料瓶口烧化。
⑦实验操作时生物安全柜的隔板要尽可能放低，尽量减少谈话，打喷嚏或咳嗽时绝对不能对着工作区，以免造成不必要的污染。
⑧瓶盖应当倒放在远离自己的地方，以避免瓶盖被误操作所污染。
⑨不要从敞开的容器口上方经过，以避免衣服上掉落不明物体对细胞的污染。
⑩实验操作时要注意及时更换巴斯德吸管、移液枪枪头和移液管，切勿一根管子做到底。一旦发现接触了非洁净或者无法确定洁净的物品必须直接丢弃。实验完毕应及时收拾，保持实验室清洁整齐，最后用75%酒精清洁台面。
（3）防止细胞交叉污染
①在进行多种细胞培养操作时，所用器具要严格区分，最好作上标记便于辨别。按顺序进行操作，一次只处理一种细胞，多种细胞多种操作一起进行时易发生t昆乱。
②在进行换液或传代操作时，粘有细胞的移液枪头和移液管不要触及试剂瓶瓶口，以免把细胞带到培养基中污染其他细胞。
③所有细胞一旦购置，或从别处引入，或自己建立，必须及时保种冻存，一旦发生污染可重新复苏细胞，继续培养。
扩展资料：
细胞培养（cell culture）是指在体外模拟体内环境（无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等），使之生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。细胞培养也叫细胞克隆技术，在生物学中的正规名词为细胞培养技术。
不论对于整个生物工程技术，还是其中之一的生物克隆技术来说，细胞培养都是一个必不可少的过程，细胞培养本身就是细胞的大规模克隆。细胞培养技术可以由一个细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化的多细胞，这是克隆技术必不可少的环节，而且细胞培养本身就是细胞的克隆。
细胞培养技术是细胞生物学研究方法中重要和常用技术，通过细胞培养既可以获得大量细胞，又可以借此研究细胞的信号转导、细胞的合成代谢、细胞的生长增殖等。
参考资料：百度百科：细胞培养
博凌科为解答：【材料】1.常规细胞培养仪器设备 恒温水浴振荡器。2.培养液（DMEM）胎牛血清（CBS）二甲基亚砜（DMSO）【操作程序】1.细胞实验室进行常规消毒，紫外照射40min以上。2.培养液（DMEM）、0.25％胰蛋白酶（Trypsin）恒温水浴箱370C预热20min，备用。3.二甲基亚砜（DMSO)在40C冰箱中冷藏30min，备用。4.从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入400C水浴中，快速摇晃，直至冻存液完全融化。5.将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml培养液，离心（1000r/min，5min）。6.用培养液悬液混悬沉淀细胞，调整细胞浓度，方培养箱中培养。7.记录复苏日期。【注意事项】1.取细胞的过程中注意带好防冻手套，护目镜。此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。2.冻存液的问题：冻存液的配置已是常识，在这里不作详述，但二甲基亚砜（DMSO）对细胞不是完全无毒副作用，在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作 较大，因此，必须在1-2min内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤，二甲基亚砜（DMSO）最好选择进口产品。3.离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。4.离心问题：目前主要有两种见解。一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液。因为离心的目的是两个，去除 DMSO，去除死细胞，这个是标准流程，但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大， 死亡。此外在操作过程中容易污染，所以不推荐。另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜（DMSO），DMSO对细胞有一定的毒副作用，所以须将离心后的液 体前倒净，且一定倒干净。我在试验中按照常规的离心分装的方法进行复苏，结果无有异常。5.细胞贴壁少的问题：教科书中说明冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml－15m培养液，而在我的试验中的经验总结为培养基越少细胞越容易贴附。6.复苏细胞分装的问题：试验中我的经验总结为复苏1管细胞一般可分装到1-2只培养瓶中，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。7.加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度，从如果你加培养基的太少，那么DMSO的浓度就会比较大，就会影响 细胞生长，从以前的资料来看，DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响，还有一个说法是1％。所以如果你的冻存液的浓度是 10％DMSO的话那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。
博凌科为解答：【材料】1.常规细胞培养仪器设备
恒温水浴振荡器。
2.培养液（DMEM）胎牛血清（CBS）二甲基亚砜（DMSO）【操作程序】
1.细胞实验室进行常规消毒，紫外照射40min以上。
2.培养液（DMEM）、0.25％胰蛋白酶（Trypsin）恒温水浴箱370C预热20min，备用。
3.二甲基亚砜（DMSO)在40C冰箱中冷藏30min，备用。
4.从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入400C水浴中，快速摇晃，直至冻存液完全融化。
5.将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml培养液，离心（1000r/min，5min）。
6.用培养液悬液混悬沉淀细胞，调整细胞浓度，方培养箱中培养。
7.记录复苏日期。【注意事项】
1.取细胞的过程中注意带好防冻手套，护目镜。此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。
2.冻存液的问题：冻存液的配置已是常识，在这里不作详述，但二甲基亚砜（DMSO）对细胞不是完全无毒副作用，在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作
较大，因此，必须在1-2min内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤，二甲基亚砜（DMSO）最好选择进口产品。
3.离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。
4.离心问题：目前主要有两种见解。一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液。因为离心的目的是两个，去除
DMSO，去除死细胞，这个是标准流程，但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大，
死亡。此外在操作过程中容易污染，所以不推荐。另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜（DMSO），DMSO对细胞有一定的毒副作用，所以须将离心后的液
体前倒净，且一定倒干净。我在试验中按照常规的离心分装的方法进行复苏，结果无有异常。
5.细胞贴壁少的问题：教科书中说明冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml－15m培养液，而在我的试验中的经验总结为培养基越少细胞越容易贴附。
6.复苏细胞分装的问题：试验中我的经验总结为复苏1管细胞一般可分装到1-2只培养瓶中，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。
7.加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度，从如果你加培养基的太少，那么DMSO的浓度就会比较大，就会影响
细胞生长，从以前的资料来看，DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响，还有一个说法是1％。所以如果你的冻存液的浓度是
10％DMSO的话那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。
答：慢冻速融里的速融就是指细胞复苏过程。 步骤: 1、 准备工作:预热完全培养基。多少℃培养的细胞就预热到多少℃ 在生物安全柜/超净工作台中,准备好细胞培养瓶/皿,并在其中添加足量预热的完全培养基。 如果需要离心去除冻存细胞中的冻存液,此时也可以准备好 15ml 离心管,在管中添加1-2ml 预热的完全培养基。
答：感受态细胞-70冻存的时候要加甘油防止结晶破坏细胞结构。复苏的时候要注意冰上溶解，并且不要有剧烈的震荡。有些细胞可能是在琼脂板上短时间4°存放的，拿出后需要在37°复苏1小时再进行体积扩大。
答：7. 复苏次日，观察细胞状态并换液，具体操作见”细胞换液”。 注意: 贴壁/半贴壁细胞接种24 h内不应扰动。部分细胞贴壁较慢，复苏后48 h不应扰动，具体注 意事项见相应细胞说明书。细胞处理原则 · 严格的无菌环境。务必保证实验室、超净台/生物安全柜和培养箱的...
答：2、细胞复苏：解冻后的细胞液在1000rpm，常温条件下离心5min，弃去上清液，加入适当体积的该类细胞需要的完全培养液，置37˚C、5%CO2条件下培养。如果加入的完全培养液的量可使解冻细胞液中DMSO的含量低于1%，可省去离心。注意：过程必须快速，DMSO在常温下对细胞有杀伤作用。复苏后根据细胞的生长...
答：关键注意事项- 严谨无菌操作，确保所有工具和双手消毒。- 冻存操作中，避免水浴过深，只需保持少许冰块。- 定期清洁和消毒生物安全柜，确保工作环境无污染。- 传代时动作轻柔，避免对细胞造成损伤。- 遵循生物安全操作规程，保持工作区的清洁划分。通过这些细致的步骤和注意事项，你可以更好地掌握H22细胞...
答：3.从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入40度水浴中，快速摇晃，直至冻存液完全融化 4.将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml培养液，离心（1000r/min，5min），有必要再弃上清，加培养液，再离心一次，把二甲基亚砜洗掉。5.用培养液悬液混悬沉淀细胞，调整细胞浓度，方培养箱中培养。6.记录复苏日期...
答：冻存过程中细胞外形成胞外冰晶的形成会对细胞膜造成机械性损伤 脱水 胞内冰晶形成 原理和内容如图所示 因此在细胞冻存复苏过程中，要从以下几个方面防止上述损伤形成：总的原则：慢冻快融，即冻存过程要逐步降温，能够使用程序降温仪当然最好了；复苏过程水温要控制适当，一般选择38℃，复苏过程要注意不...
答：细胞通常储存在液氮中，其温度可达-196℃，在理论上，只要保持这样的低温条件，细胞的储存时间几乎是无限的。冻存与复苏细胞的基本原则是慢冻快融，这种方法已被实验证明能够最大限度地保持细胞活性。本文将重点介绍原代细胞的冻存与复苏步骤。1. 检查 在收到细胞株包裹时，立即检查细胞株冷冻管是否有...
答：探索Hep G2细胞的培养艺术与复苏策略 在肝癌研究的舞台上，Hep G2细胞作为不可或缺的模型，其培养的精细步骤与复苏技术至关重要。首先，选择合适的培养基至关重要，如DMEM和RPMI-1640，其中添加10%的胎牛血清为细胞提供了丰富的营养。在适宜的环境中，将培养箱设定在恒温37℃，保持5%的二氧化碳浓度，...
答：细致操作的艺术原代培养需要精细操作，首先从组织中分离并消化分散细胞，调整密度后在适宜条件下培养，通常3-5天内观察细胞生长。细胞黏附生长后，每隔2-3天更换一半培养液，满瓶壁后进行传代。关键步骤与注意事项无菌操作是细胞培养的基石，防止污染至关重要。选用适合细胞的培养液和胎牛血清，胶原酶溶液需...
