细胞复苏、 换液、传代、 冻存protocol

复苏
细胞复苏是指将冻存在液氮或-80℃的细胞解冻，恢复其生长的过程。操作原则：快！慢冻速融里的速融就是指细胞复苏过程。

步骤：
1、 准备工作：预热完全培养基。多少℃培养的细胞就预热到多少℃
在生物安全柜/超净工作台中，准备好细胞培养瓶/皿，并在其中添加足量预热的完全培养基。
如果需要离心去除冻存细胞中的冻存液，此时也可以准备好 15ml 离心管，在管中添加1-2ml 预热的完全培养基。

2、 解冻细胞。
做法有 2 种选择：
(1)从-80℃或液氮中取出冻存的细胞，迅速入 37℃水浴，轻摇解冻。冻存管口保持在水面上，以免水浴锅中的水进入管中。
如果冻存细胞的地方离细胞房水浴锅较远，可以准备一个干净的烧杯，烧杯中装 37℃ 水，带着烧杯去取细胞以实现迅速入水浴，或者路上利用体温手搓冻存管到达水浴 时如未充分解冻再投入水浴继续解冻。当冻存管中只剩一点小冰粒时，酒精棉擦拭冻存管外表面，移入生物安全柜/超净工作台。
(2)从-80℃或液氮中取出冻存的细胞，迅速酒精擦拭冻存管外表面，移入生物安全柜/ 超净工作台，向冻存管内加入适量预热的完全培养基，并轻轻吹打以促使细胞融化。这个做法适合冻存管中有足够空间以容纳新加入的新鲜培养基。自己可以尝试一下，哪种方法细胞融化速度快就用哪种方法。个人认为第 2 种快。

3、 接种细胞：
此时做法有 3 种选择：
(1)如果是对冻存液成分耐受的细胞，可将冻存管中的细胞直接吸入准备好的培养瓶/皿， 轻轻十字摇晃混匀细胞，放入细胞培养箱。
(2)如果是对冻存液成分不耐受的细胞，将冻存管中的细胞吸入准备好的 15ml 离心管中，500g ×3min 离心，去除上清，1ml-2ml 预热的完全培养基重悬细胞沉淀并转移到准备好的培养瓶/皿。
(3)如果是对冻存液成分不耐受的细胞，用解冻细胞第 2 种方法的，可以直接用冻存管离心，500g ×3min 离心，去除上清，1ml-2ml 预热的完全培养基重悬细胞沉淀并转移到准备好的培养瓶/皿。
4、 第二天光镜下观察细胞。如果是带着冻存液一起接种的细胞应进行换液。

细胞换液
细胞换液是指去除旧的培养基，换成新的完全培养基以继续提供细胞充足的营养支持。当旧培养基 ph 值改变（含酚红的培养基通常是变酸发黄）时，需要及时进行换液。
步骤：
1、 准备工作：
预热完全培养基，酒精棉擦拭培养基瓶外表面后移入生物安全柜/超净工作台。
细胞培养箱中取出的细胞，酒精棉擦拭培养瓶/皿外表面，移入生物安全柜/超净工作台。可以稍等待，待生物安全柜中的循环风将试剂瓶和培养瓶的外表面吹拂几分钟后，拧开培养基瓶盖虚掩，拧开培养瓶瓶盖虚掩，培养皿盖不用拧。

如果是贴壁细胞，可以用全量换液法，直接吸去全部旧培养基，补充足量新鲜完全培养基。

如果是悬浮细胞，可以用半量换液法，即吸去一半旧培养基，补充新鲜完全培养基。（会损失一半细胞）。悬浮细胞如果不想损失细胞，那就需要将培养物转移到离心管中，离心去除旧培养基，再用新培养基重悬细胞沉淀。

不光细胞维持培养时需要进行细胞换液，一些实验操作也需要进行细胞换液。当换液操作是实验需要时，可能在添加新的培养基前需要 PBS 清洗细胞以去除旧培养基的影响， 新添加的培养基也可根据实验需求进行特殊配制，不一定是完全培养基。

细胞传代 是指将细胞培养物分出来，重新接种到新的培养瓶/皿内，使细胞重新获得足够的生长空间的过程。

对单层生长的 贴壁细胞 而言，当细胞汇合度为 80%左右时，细胞状态是最好的，此时适合进行传代。

预热完全培养基、DPBS、胰蛋白酶或其他可解离细胞的试剂，酒精棉擦拭瓶外表面后移入生物安全柜/超净工作台。

细胞培养箱中取出的细胞，酒精棉擦拭培养瓶/皿外表面，移入生物安全柜/超净工作台。可以稍等待，待生物安全柜中的循环风将试剂瓶和培养瓶的外表面吹拂几分钟后，拧开试剂瓶盖虚掩，拧开培养瓶瓶盖虚掩，培养皿盖不用拧。

吸去旧的培养基，DPBS 洗细胞 1-2 次，加入消化液（胰蛋白酶或含 EDTA 的胰蛋白酶或无动物成分来源的 TryplLE），轻轻晃动培养瓶/皿，使消化液能均匀布满所有细胞。

一些强贴壁的细胞，如果使用胰蛋白酶消化，可以用胰蛋白酶代替 DPBS 清洗细胞，并在 37℃进行消化（加上消化液后放进 37℃细胞培养箱）。

用含EDTA 的胰蛋白酶来消化细胞的话，消化速度会更快。

强贴壁细胞或用特殊的无血清培养基培养的细胞使用 TrypLE 消化。

细胞消化的同时可以准备新的培养瓶/皿，往培养瓶/皿中添加适量新鲜培养基。

当镜下观察贴壁细胞直接的连接松散，细胞有所变形，但还没有出现大片脱落时，吸去消化液，稍待一两分钟，让残留在细胞表面但是肉眼看不见的消化液进一步消化。

加入适量完全培养基，轻柔吹打细胞（用一层层“扫描”方式来吹打），不要忘了沿边“清扫”。胰蛋白酶可以被完全培养基中含的血清终止。

EDTA 无法被终止，因此含 EDTA 的胰蛋白酶消化的细胞，可以在加完全培养基吹打之前用DPBS 洗 1-2 遍。

TrypLE 无需终止，DPBS 稀释即可，因此也可以在加完全培养基吹打之前用 DPBS 洗 1-2 遍。

最好控制不要消化过度，细胞成片脱落。当细胞消化过度时，只能通过离心去除消化液了。

吹打细胞时注意轻柔，控制泡沫，以免对细胞造成太多的细胞损伤。吸不净，吹不净， 枪尖始终保持在液体中可以有效控制泡沫产生。

在加入新培养基吹打细胞时即可规划好，打算一盘细胞分成 N 盘，那就用 0.5N/1N ml 培养基进行细胞吹打。

将细胞吹打成细胞悬液后即可每个新瓶/皿接种 0.5 或 1ml，十字混匀后，送入细胞培养箱继续培养。

通常细胞可以 1:2、1:3、1:4 传。有些细胞不能传太稀，容易状态不好生长缓慢。

对悬浮细胞而言，因为不需要消化，传代过程比较简单，直接吸取一定量旧培养物接种到新培养瓶/皿即可。

细胞冻存 主要为了细胞保种，是指将细胞置于保护性液体中于低温中长期储存的技术。

对单层生长的 贴壁细胞 而言，当细胞汇合度为 80%左右时，细胞状态是最好的，此时适合进行冻存。

预热完全培养基、DPBS、胰蛋白酶或其他可解离细胞的试剂、DMSO 或无血清细胞冻存液，酒精棉擦拭瓶外表面后移入生物安全柜/超净工作台。

细胞培养箱中取出的细胞，酒精棉擦拭培养瓶/皿外表面，移入生物安全柜/超净工作台。准备无菌细胞冻存管和 15ml 离心管，移入生物安全柜/超净工作台。

准备程序冻存盒（恢复至室温）。如果使用添加异丙醇的程序冻存盒，注意异丙醇的量， 如不足，需添加，并且应该根据程序冻存盒说明书定期更换异丙醇。

按细胞传代的做法进行细胞消化，吸去消化液后，1-2ml 完全培养基吹打成单细胞悬液。对悬浮细胞而言，无需消化，直接进入下一步离心收集细胞。

将单细胞悬液转移到 15ml 离心管，500g×3min 离心，去除上清。

如使用无血清细胞冻存液，直接吸取无血清细胞冻存液重悬细胞，然后转移到冻存管中拧紧盖子。

如使用自制的细胞冻存液，需要先配制好细胞冻存液，方法如下：

优先使用培养该细胞的新鲜完全培养基配制，900ul 完全培养基+100ul DMSO=1ml 细胞冻存液（DMSO 含量 10%）。

DMSO 在加入培养基时会发热，务必提前配制好冻存液，以免过热损伤细胞。

对于娇弱的细胞，可配成 2×细胞冻存液，先使用一定体积新鲜完全培养基重悬细胞，再逐滴滴加等体积 2×细胞冻存液（DMSO 终浓度还是 10%），吹打混匀，转移到冻存管中。

自制细胞冻存液中的 DMSO 可适当降低，5%-10%都可以，胎牛血清可以提高至 20%。

在冻存一些比较娇弱的原代细胞时，冻存液中的完全培养基可以用胎牛血清替代，即冻存液中只含胎牛血清和DMSO。

冻存细胞的量可以参考传代时的比例，原则是让复苏的细胞有充足的生长空间。推荐使用内旋式细胞冻存管，比较安全。

有些细胞冻存管的管盖设计是特殊的，当第一次感觉拧紧时，此时并没有真正拧紧，可以进一步拧，直到第二次感觉到拧紧。推荐使用这样的冻存管，在温度变化发生热胀冷缩时不容易发生液体泄漏，减少污染的可能性。

使用无血清冻存液重悬的细胞，无需程序降温，直接塞-80℃冰箱降温，第二天转移到液氮中。

使用自配细胞冻存液的细胞，需放进程序冻存盒后再置于-80℃冰箱中，第二天转移到液氮中。

-80℃不适合长期保存冻存细胞（大概 1-2 年吧）。液氮中冻存的细胞十年之久都可以复苏成功。如需要更长期地保存细胞，应该定期复苏细胞后再次冻存。

程序冻存盒也可以自制，即使用大量脱脂棉花包裹冻存的细胞，或使用海绵包裹细胞。

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