木霉分生孢子的液-固联合培养制备

pda培养基即可

总起来看，对木霉菌的制剂加工研究较少，木霉菌的大量培养技术尚处于模仿阶段，一般采用液体或半固体生产方法，以得到大量的菌丝、厚垣孢子或分生孢子（杨合同等，1999b）。基于活跃的菌丝比分生孢子更为有效的假设，Lewis等（1989）发展了两种制剂与相应的使用技术。其中一种是，先将麦麸用水打湿，灭菌后接种木霉菌，培养2～3d（而非传统的2～3周），这种制剂可使生防菌在土壤中迅速生长，杀死或钝化土壤中的病原菌，试验证实，菌剂对于S.rolfsii，R.solani和P.ultimum引起的病害有良好的防治效果。在另一种方式中，含有麦麸的蛭石作为培养基使用，接种木霉菌后任其生长，然后予以干燥。这种菌剂至少可存放24周不失效，使用前，用稀酸稀释，培养2d使菌丝呈现活跃生长状态，然后施于土壤中，对R.solani引起的甜菜和棉花立枯病有效，这种制剂的形式与加工方法的优点在于储存和活化过程不必保持无菌条件，但使用不方便，储存期短是其弱点。
为了更好地延长储存期，增加使用的方便性和有效性，需要对木霉剂型进行研究，确定其制备工艺。目前，木霉菌制剂剂型主要有可湿性粉剂、水分散颗粒剂、油悬浮剂、水悬浮剂和微胶囊剂。
12.5.3.1 可湿性粉剂
可湿性粉剂是用微生物繁殖体、惰性填料和湿润剂、分散剂等助剂（达到一定粉粒细度），按比例经充分混合后的剂型。加到水中后能被水湿润、分散，形成悬浮液，可喷洒施用。
助剂、载体筛选见下节“助剂与贮存因素”部分。木霉菌可湿性粉剂的组成如下：一定量木霉菌分生孢子、润湿剂（如十二烷基硫酸钠SDS）、分散剂和保护剂（如甲基纤维素、糊精、十二烷基硫酸钠、黄原胶和黄腐酸钠）等、载体（如高岭土、膨润土、麦饭石）等，将上述物料按比例添加至搅拌机中混合均匀即可。目前，木霉菌制剂大多采用该剂型。
12.5.3.2 水分散颗粒剂
水分散颗粒剂由微生物繁殖体、润湿剂、分散剂、崩解剂、稳定剂、黏结剂等助剂和填料组成，其制备方法参照化学农药制备方式，同时考虑木霉菌的特点，制备该制剂主要采取将润湿剂、分散剂、崩解剂、稳定剂、黏结剂等通过物理方法将其粉碎至一定细度，然后与木霉菌混合均匀，经流化床造粒干燥而成，粒度0.1～1.0mm。
12.5.3.3 油悬浮剂
油悬浮剂是由微生物繁殖体与适宜的助剂制成的稳定的非水悬浮剂。Mujtaba（2011）研究了菜籽油-甘油油剂、甘油制剂、石蜡油-豆油制剂、石蜡油-印楝油制剂对孢子的影响，表明分别在石蜡油和印楝油中保存较好，存活率达到70%以上；仅豆油或豆油-石蜡油制剂120 d后孢子保存率达到35%以上；6个月后，孢子存活率最高的是菜籽油-甘油制剂，其次是甘油制剂；12个月后只有菜籽油-甘油制剂孢子存活率达到10%，其次是石蜡油制剂。
12.5.3.4 水悬浮剂
水悬浮剂是在助剂（润湿分散剂、增稠剂、结构调节剂、消泡剂、防冻剂、防腐剂、酸碱调节剂等）作用下，将不溶于水的微生物繁殖体分散到水中形成均匀稳定的水分散体系。化学农药式的制备方式不适合微生物源农药。对于微生物源活体制剂，利用微流控技术制备水包油式的微囊，然后分散于水中，制成水悬浮剂是木霉菌水悬浮剂的发展方向。
12.5.3.5 微胶囊制剂
微胶囊技术是利用一种用天然或合成高分子成膜材料，把分散的固体、液体或气体包覆使形成微小粒子的技术，微胶囊粒径一般为2～1000μm。被包覆物通过密闭的或半透性的壁膜将目的物与周围环境隔离开来，从而达到保护和稳定芯材、屏蔽气味或颜色、控制释放芯材等目的，成为一种新型农药剂型。适合微生物活体的微胶囊壁材主要有褐藻酸钠、多孔淀粉等，固化剂采用氯化钙、壳聚糖、阿拉伯胶等，填充物主要有玉米蛋白粉、糊精等，保护剂主要有脱脂奶粉、味精、甘油等。干燥方法主要有喷雾干燥法、流化床干燥法等。

12.5.1.1 木霉菌种筛选与制备

木霉菌株的高效与否主要在于其根部定殖、拮抗病原菌、溶壁、重寄生病原菌等方面的能力，为此，筛选木霉主要要考察以上几方面的能力。

木霉分生孢子与植物凝集素、植物病原菌产生凝集素，发生特异性凝集反应可以作为木霉根部定殖和拮抗能力的筛选模型。作者发现木霉菌的分生孢子可以被植物产生的凝集素以及植物病原菌（棉花枯、黄萎病菌和立枯病菌）产生的凝集素所特异性凝集，两种凝集反应的程度分别与木霉菌在作物根际的定殖能力和木霉菌对病原菌的拮抗能力以至防治效果有关，可用来快速筛选有效的木霉菌菌株（杨合同等，1999）。

利用平皿对峙培养法可分离产生抗生素的木霉菌。通过平皿对峙培养，木霉菌产生的抗生素（包括挥发性和非挥发性）可在平皿内抑制病原菌的生长，选取生长速度快、抗生素产量高和重寄生能力强的木霉菌株作为候选菌株，进入下一步的复筛。

菌株的细胞壁降解酶产生能力也可作为木霉初筛的模型之一。利用唯一碳源（如几丁质、葡聚糖、纤维素等）作为筛选培养基，选取透明圈产生时间短且大的菌株作为复筛菌株。

分子生物学技术可以作为筛选目标菌株或生防基因的模型。由于可培养微生物相对较少，利用分子生物学方法提取土壤DNA进行16 S rDNA分析，可提供土壤微生物种群结构信息，为筛选安全目标菌株提供指导。Peer等（1991）、Mighel等（1994）用筛选标记挑选土壤和叶面上的T.harzianum安全分离株；Hjeljord（1996）利用分子生物学技术检测田间试验中生防菌株。

利用种子发芽试验、盆栽实验、小区试验等对初筛菌株进行复筛，方法主要有种子发芽率、盆栽接种病原菌与生防菌、小区应用等，利用技术主要有基因沉默技术、单克隆抗体、筛选标记、荧光成像技术和染色鉴别等。利用荧光成像技术和染色鉴别等方法可以原位对木霉—病原菌互作进行观察（Bulk/Kit ASO et al.，1999；Orr et al.，2004）。进行单克隆抗体识别 T.harzianum的分生孢子和菌丝体，这种单克隆抗体可以研究土壤中T.harzianum和R.solani的相互作用（Thornton，1996）；也有利用该技术进行堆肥中木霉与其他真菌重寄生的研究（Thornton et al.，2002）；β-葡聚糖酶基因转入T.harzianum中，以它的报道基因作为筛选标记（Green et al.，1995；Thrane et al.，1995），在土壤混合种群中研究木霉的活性（Green et al.，1996）；利用基因沉默技术研究重寄生相关基因（Omann et al.，2012）。

高效木霉菌株的制备。将木霉菌试管菌种在PDA培养基上进行单孢子活化后，接种无菌PDA茄形瓶或无菌（PD）培养基，在28℃恒温条件下培养3～5d（固态）或24～36 h（液体），待分生孢子布满茄形瓶后，用无菌生理盐水或含0.1%Tween-80无菌水溶液冲洗，得到的孢子悬浮液可作为液体发酵菌种使用（Sargin et al.，2013）；待液体培养基OD₆₆₀值达到2.0以上后，进行显微镜检查，确认无杂菌污染后即可作为液态菌种使用。

12.5.1.2 液体发酵培养基

液体发酵培养基选择应综合考虑当地资源和成本，选择当地便宜易得、价格低廉的自然培养基，碳源主要来自当地农业产品或副产物，例如麦麸、木屑、稻糠、棉籽废弃物、葡萄果渣、花生壳粉等；氮源主要包括酵母提取物、豆饼粉、麦芽粉、蛋白胨、葡萄酒糟、棉籽粉、硫酸铵等（Sargin et al.，2013）；还包括玉米粉或麦麸、豆饼粉、酵母粉等组成的自然培养基。

（1）不同碳源对菌丝生长的影响。基础培养基为：蔗糖20 g，硝酸铵5g，磷酸钠2g，硫酸镁1g，蒸馏水1L。碳源分别有玉米粉、红糖、葡萄糖、果糖、淀粉、麦芽糖、半乳糖、甘露醇等，以上述碳源与蔗糖置换，在28℃下振荡培养（180 rpm以上）。第3天测菌丝干重。结果显示，以玉米粉、红糖为碳源培养菌丝干重最大；以淀粉、蔗糖、麦芽糖、半乳糖为碳源次之；以葡萄糖、果糖为碳源最少。

（2）不同氮源对菌丝生长的影响。在上述基础培养基中分别用等量的蛋白胨、氯化铵、酵母粉、硫酸铵、尿素、硝酸钾、豆饼粉等氮源与其中的硝酸铵置换，配制成不同氮源的培养液，培养方法及测量方法同上。结果显示，豆饼粉、酵母粉为氮源菌丝生长量最大；以蛋白胨、氯化铵、硝酸铵、硫酸铵为氮源的菌丝生长量次之；以尿素、硝酸钾为氮源的菌丝生长量最少。

（3）不同金属元素对菌丝生长的影响。以玉米粉、豆饼粉、酵母粉为基础培养基，添加磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸亚铁、氯化钾在上述培养条件下培养3d，测定菌丝干重。结果显示，添加硫酸镁、磷酸二氢钾的培养液菌丝生长量最大，氯化钾次之，硫酸亚铁最少。

综上所述，木霉菌液体发酵培养基推荐为：

合成培养基：葡萄糖或蔗糖、酵母粉或蛋白胨和硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸亚铁等。

自然培养基：玉米粉或麦麸、豆饼粉或酵母粉、硫酸镁、磷酸二氢钾等。

12.5.1.3 固体培养基

（1）碳源的影响。自然培养基以麦麸、稻糠、棉籽废弃物、葡萄果渣、木屑、花生壳粉为碳源，在初始湿度70%，初始pH 5.5±0.3，接种量5g/mL木霉菌孢子悬液1.0×10⁸孢子/mL，28℃培养4d，麦麸培养基分生孢子产量最高，达到1.0±0.8×10¹⁰孢子/gds，稻糠次之，达到9.2±0.5×10⁹孢子/gds，花生壳粉最差（Sargin et al.，2013），综合代谢产物及孢子产量等因素，选择麦麸作为自然培养基仍是最优选择（Höker et al.，2005）。

固态培养基可以采用沸石、蛭石、珍珠岩、稻壳、甘蔗渣、黏土粒等作为吸附剂（Silman et al.，1991，1993），以Vogel盐溶液（25mM硝酸钠，0.8M蔗糖）（Irshad et al.，2011）为基础培养基，添加不同浓度葡萄糖，上述条件下培养4 d，测定结果显示，分生孢子含量随着葡萄糖浓度的增加而增加，但没有显著性差异，考虑经济性原则，建议添加1%葡萄糖。

（2）氮源的影响。在麦麸培养基和上述沸石培养基基础上，添加不同的氮源，如酵母粉、豆饼粉、蛋白胨、尿素、大麦芽、葡萄酒糟、玉米浸膏等在上述条件下培养4 d，添加酵母粉的麦麸培养基、添加蛋白胨的沸石培养基分生孢子产生量最大。

为了确定麦麸和酵母粉的最佳配比，按照酵母粉：麦麸＝20：80、40：60、60：40、80：20 比例进行试验，最后确定酵母粉：麦麸最佳配比为40：60，分生孢子产量达到1.30±0.65×10¹⁰孢子/gds（Sargin et al.，2013）。

12.5.1.4 培养条件

在液体培养条件下，主要对初始pH、培养温度、培养时间、接种量、振荡频率、装液量等参数进行优化，根据木霉菌的菌株特性不同，目的产物不同设计不同的试验方案，作者利用T.viride LTR-2为目标菌株，以菌丝生长量为目的产物优化了该菌株的最优培养条件：初始pH为5.5～6.5，培养温度为28～30℃，培养时间为24～36h，接种量为5%，振荡频率100～120 rpm，500三角瓶装液量100mL。

在固体培养基培养条件的研究中，Sargin等（2013）研究了沸石培养基、麦麸培养基、麦麸-大麦芽培养基不同初始湿度对木霉菌分生孢子的影响，结果表明，沸石培养基最佳初始湿度为60%（w/w），麦麸培养基和麦麸-大麦芽培养基初始湿度均为70%（w/w）。Pandey等（2001）研究了真菌的初始pH为3.5～6.8；Nampoothiri等（2004）指出低pH可以避免细菌的影响；Sargin等（2013）利用麦麸-大麦芽培养基研究了不同pH条件下的分生孢子产量，显示该培养基的天然pH（5.5～6.1）是最适合木霉生长和产孢的；对培养温度的研究也与液体发酵结果一致，以28～30℃为宜。

12.5.1.5 木霉分生孢子的收集

木霉菌种在固体培养基上生长3～4d后，孢子长满培养基表面，用适量的灭菌蒸馏水或生理盐水（0.9%NaCl溶液）从培养基上洗下孢子，转移到装有无菌玻璃珠的试管中，涡旋振荡，即可获得稀释好的木霉孢子悬浮液；悬浮液可采用离心法或过滤法进行浓缩。

12.5.1.6 木霉分生孢子干燥

微生物干燥方式主要有冻干法、喷雾法和流化床法，Sargin等（2013）利用冻干法和流化床法对木霉分生孢子进行了干燥研究，并通过添加渗透剂提高了分生孢子的干燥成活率，在添加10%甘油，40℃干燥24 h情况下，孢子成活率达到97%；Harman等（1991）在培养基中加入PEG、甘油等，降低了培养基的水势，为-2～-4MPa，获得了高耐干燥的分生孢子。喷雾法和冻干法干燥分生孢子均不能得到较好的成活率。