木霉系统发育研究历史回顾

依据形态学对木霉的无性型和有性型进行描述，已经接近极限（Samuels，2006）。要深入研究，分子手段的介入必不可少。研究木霉的系统发育所采用的分子手段较多，一般涉及的基因及其片段如表1.3所示，所绘制的系统发育树也因所用菌株及基因的不同而有所不同。图1.7所示为Samuels于2006年综合RPB2及TEF-1a序列信息，采用邻接法绘制的木霉已知种类的系统发育树，树中包括了大多数研究比较详细的木霉种类。

表1.3 木霉/肉座菌分子系统发育研究所采用的基因序列

注：*表示片段上简约信息点数量比例值；**表示仅检验了关系密切的分类单元；***表示来自Longibrachia-tum组的数据不可用。
（Druzhinina，2005a）

早期文成敬等（1993）对中国西南地区的木霉属进行了分类研究，鉴定并描述9个集合种，并制定了检索表。后来逐渐采用Gams＆Bissett（1998）重新修订的形态学分类系统。孙军等（2006）采用重新修订的形态学分类方法从辽宁省内分离鉴定12个种，分别是 T.pseudokoningii，T.longibrachiatum，T.virens，T.spirale，T.fertile，T.strigosum，T.longipile，T.hamatum，T.viride，T.koningii，T.atroviride和T.harzianum，其中，T.longipile为中国新记录种。
ZHANG Chulong等（2004）采纳形态生理学分类特征和分子序列（ITS1和ITS2，tef1）分析的方法，发现木霉种类 17个，分别是Trichoderma citrinoviride，T.longibrachiatum，T.sinensis，T.atroviride，T.koningii，T.viride，T.asperellum，T.hamatum，T.erinaceum，T.harzianum，T.inhamatum，T.velutinum，T.cerinum，T.strictipile，T.spirale，T.virens，H.nigrovirens（Trichoderma sp.），其中，T.asperellum，T.cerinum，T.spirale和T.velutinum为国内新记录种。此后不断有新记录种或新种的报道，ZHANG等（2007）从紫杉上分离一株内生真菌T.taxi；YU Zefen等（2007）从云南烟草根际分离两株国内木霉新记录种T.compactum和T.yunnanense。YUAN等（2008）从石斛上分离一株内生木霉T.chlorosporum；贾东晨等（2009）从新疆沙漠植物园发现一个国内新记录种T.brevicompactum。顾金刚等（2009）报道国内新记录种T.ovalisporium，李广记等（2010）发现一个中国新记录种T.koningiopsis。孙瑞艳等（2013）从南部地区土壤中分离中国新记录种T.intricatum和T.stromaticum。张广志等（2013）发现两个中国新记录种T.pleuroticola和T.pleurotum。Li Qirui等（2013）发现一个木霉新种T.guizhouense。截至目前，国内报道木霉种类达到32个。
结语
随着分子技术的介入，木霉在形态学分类和分子系统学研究上取得了重大进展，不仅从研究无性型木霉菌发展到研究全型的真菌，分类性状也从单一的形态学发展到综合形态学、生理生化、分子系统学等各方面的性状。分子系统学也从单基因的系统发育分析到多基因的系统发育关系研究。木霉种类越来越多，新的分类鉴别技术也不断涌现，为进一步提高木霉及其有性型鉴定的精确性，充分利用好木霉这一重要资源提供了技术上的可能。但是对木霉的组、种间的亲缘、系统发育演变关系等问题还没有最终解决，对木霉与其有性型的关系还未完全确定。要想最终建立木霉的自然分类系统，还必须坚持从全型真菌出发，综合形态学、生理生化、分子系统学等各方面的研究成果。

对木霉系统发育的研究，最早采用的是形态学手段，后来逐渐过渡到分子技术，其中也广泛存在酶学及其他一些生理生化手段。包括DNA序列分析（Appel et al.，1996）、随机扩增多态性DNA（RAPD）（Kelly et al.，1994；Woo et al.，1996；杨合同等，2004a）、限制性片段长度多态性（RFLP）和同工酶分析（Ho et al.，1985；Elias et al.，1992）等。

1.3.1.1 蛋白标记（同工酶分析）技术

评估遗传变异的一个常用的方法是同工酶电泳。同工酶分析被用于区分木霉属的近缘种（Szekeres et al.，2006），能快速、节约地分析大量的木霉菌株。氨基酸序列的不同导致蛋白特性的差异，同时改变了在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的移动速率（Rosendahl et al.，1992），电泳结束后通过对比已公布的染色谱，可直观地反映不同的酶类多样性（Pasteur et al.，1988；Harris et al.，1976）。

Zamir等（1985）首次用同工酶分析描述木霉种类特征，将23株不同地理位置的哈茨木霉分为5个类型。结果表明，同工酶电泳对木霉属种间水平的区分是非常有用的。Stasz等（1988a）采用水平淀粉凝胶电泳技术评估了木霉63个酶在木霉系统发育的支序分析上的应用。Samuels等（1994）利用淀粉凝胶对 23种酶进行分析，以检测T.longibrachiatum，T.pseudokoningii和T.reesei。Leuchtmann等（1996）利用10个同工酶系研究了Longibrachiatum组木霉的78个菌株的酶的亚组。Szekeres等（2006）发现7个适当的酶可鉴定 T.pseudokoningii，T.koningii 或 T.citrinoviride，分类结果支持 Bissetts（1992）基于形态学特征的木霉组的分类体系。Grondona等（1997）对T.harzianum的15个菌株，分析了形态学、生理、分子和生化特征及6个同工酶系统99条同工酶带，通过数值分类将这15株哈茨木霉分为4组。Siddiquee等（2007）研究了14个基因位点编码的9个同工酶系的电泳差异，以区分T.harzianum，T.aureoviride和T.longibrachiatum 3个木霉种47个菌株。张超等（2012）选取14个种类的21株木霉菌株，采用植酸酶保守序列设计兼并引物P8205，P500-2扩增获得植酸酶基因片段，建立系统发育树，结果表明，植酸酶基因序列具有多样性的特点，与基于ITS序列的分类结果基本相同。

可溶性蛋白质凝胶电泳也是真菌类鉴定和分类方面的一种重要手段。例如，陈建爱等（1999）利用可溶性蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳对6种共26个木霉菌菌株进行特征性图谱分析，发现种间蛋白质电泳图谱差异显著，种内菌株间基本一致。肖性龙等（2002）对61株不同木霉菌株进行可溶性蛋白质电泳分析，结果表明，哈茨木霉菌存在种下分类群。

1.3.1.2 BIOLOG 微平板分析技术

BIOLOG微平板分析方法是一种群落水平的生理特性分析方法。它是根据微生物利用碳源能力的不同，利用Biolog GN系统来研究微生物的碳源利用模式的方法。Biolog GN微滴定板的每一个孔中含有一种不同的碳源、其他营养物和四氮唑染料。接种微生物悬浮液于微滴定板孔中后，由于不同微生物对不同单一C源利用程度和强度不一样而发生不同生化代谢反应，从而呈现不同程度的颜色，这种颜色变化可以通过酶标仪测定和记录下来，这样便可得到微生物特有的“代谢指纹”，根据土壤微生物的代谢指纹图谱，结合有关计算机软件和已有的菌种库资料，可以得到某些微生物的分类鉴定（Winding et al.，1997）

Kubicek等（2003）引入Biolog FF Microplates手段，研究了木霉种类的表型生理特性的差异。利用光比色（96 h，测定浑浊度表示菌丝生长量）测定木霉菌株对95种碳源的利用情况和线粒体活性。该技术能够提供种类特异性模式，有利于区分近似种类，但对了解系统进化关系帮助不大。Bissett等（2003）利用ITS和EF-1a序列描述亚洲的7个新种时，也用到了Biolog方法测定菌株的生理特性。从进化枝图上可以清晰看出，B4进化枝可分为以下亚进化枝：T.harzianum，T.helicum和T.virens。Druzhinina等（2006a）利用Biolog微阵列技术评价H.jecorina（T.reesei）对95种碳源的利用情况，比较了野生型、突变体和转化菌株对碳源利用的差异。该技术的重复性、简便性及高分辨率使其成为分析突变和转化菌株及基因功能的整体分析有力的研究工具。

1.3.1.3 DNA序列（ITS）分析技术

分子工具在真菌分类中的出现，促使研究人员在20世纪90年代中期重新审视基于形态学的木霉分类系统。G.J.Samuels（Beltsville，MD，USA），T.Borner（Berlin，FRG）和C.P.Kubicek（Vienna，Austria）实验室合作，率先对Bissett的Longibrachiatum组进行了修订，其使用的技术包括多种分子标记技术（ITS1和ITS2序列分析，RAPD），生理学（同工酶分析）和表型特征，并且首次将包括了该组Trichoderma种类可能的有性型作为研究对象（Kuhls et al.，1996，1997；Samuels，1996；Samuels et al.，1998；Turner et al.，1997）。结果是，Longibrachiatum组在系统发育上是独立的，并且包括10个分类单元，其中有4对为无性-有性关系：H.schweinitzii/T.citrinoviride，H.pseudokoningii/T.pseudokoningii，H.jecorina/T.reesei和H.orientalis/T.longibrachiatum。该研究还进一步将Saturnisporum组［只包括两个种即T.saturnisporum和T.ghanense（Doi et al.，1987）］合并在Longibrachia-tum组中，确认T.ghanense为T.parceramosum的同义名。但是，总体上Bissett（1984）所建立的Longibrachiatum组的概念得到确认，表明木霉的形态分类和分子分类技术之间具有密切关系。Longibrachiatum组是木霉中较小的组，系统发育上与其他组的关系比较远。

当研究木霉中较大的组时，形态特征与分子系统发育之间的关系就变得复杂。Kindermann等（1998）第一次试图分析整个木霉属的系统发育，采用对rDNA的ITS1区进行序列分析的方法，发现Pachybasium组实际上是并系的（paraphyletic）组群或者分类单元。这一结果被后来用多个基因进行的研究结果所证实（Kullnig-Gradinger et al.，2002；Chaverri et al.，2003b）。Lieckfeldt等（1999）采用形态学及ITS和LSU 序列分析方法，证明T.viride进化枝至少包含另外一个种即T.asperellum，还发现另外几个分枝进化路线。Dodd等（2003）也发现该进化枝应该被进一步分为数个分类单元。Lieckfeldt等（2001）采用ITS序列分析防范，确定了T.aureoviride的系统发育位置，该种在木霉属处于独立位置，与其他种类的区别特征是生长速度非常慢。Chaverri等（2001）发现了T.virens的有性阶段，并采用ITS和tef-1序列进行了特征描述，结果证明，木霉与其有性阶段的关系可以采用分子手段来确认，并认为该种与H.lixii（T.harzianum）关系密切。

1.3.1.4 多基因研究（GCPSR）技术

自Taylor等（2000）将系谱系统发育种类认定（Genealogical concordance phylogenetic species recognition，GCPSR）概念引入真菌分子分类学以后，多基因研究手段被用于木霉的分类研究。Dodd等（2000）的研究表明，ITS有时不足以解决关系密切的分类单元之间的关系问题，特别是在T.harzianum和T.viride进化枝的关系方面不能得到足够信息作进一步分析。tef-1和rpb2大型内含子的组合是最合适的工具，但并不适合所有分类单元的所有研究目的。Kullnig-gradinger等（2002）将ITS，28S，mitSSU，tef1和ech42序列综合起来，用于更多种类的分析，结果进一步支持Pachybasium组的次级分类。Samuels等（2002）采用ITS和tef-1序列结合生长温度的关系，将显微镜下难以区分的T.aggressivum和T.harzianum区别开来，但是两个分类单元仍然位于T.harzianum进化枝当中。

Dodd等（2003）发现了T.atroviride的有性阶段，并采用ITS和EF-1a序列分析方法研究了其特性，区分除了4个亚进化枝，其中一个局限于新西兰地区特有的种类。另外发现T.viride和T.koningii是异源性的。H.atroviridis也与首先在竹子上发现的H.muroiana有明显区别（两者在此前也是不易区别的类型）。Chaverri等（2003a）采用4种序列证实了H.lixii与T.harzianum的关系，在T.harzianum/H.lixii中可区别几个谱系，但没有发现可用于明确鉴别的形态特征。Lu等（2004）继续了Chaverri等（2003a）的工作，采用的是ITS、ech-42和tef-1 序列，将重点放在产生白色分生孢子的种类上，研究结果发现，T.polysporum和T.piluliferum是密切相关的种类，与Chaverri和Samuels（2003）的研究结果不同。

Chaverri等（2003c，2004）采用RPB2和EF-1a序列，专门研究了40个具有绿色子囊孢子的Hypocrea种，这些种类并非单系种类，但都被看作出自Hypocrea的种类。描述的新进化枝包括Chlorospora，Virescentiflava，Strictipilosa和Gelatinosa，H.aureoviridis并未在基点位置上。Holmes等（2004）描述了T.ovalisporum，为内生菌，属于T.koningii集合。T.viride进化枝的异源特性再次表现在tef-1 序列中。Kraus等（2004）描述了T.brevicom-pactum，该种与H.lutea关系密切，在ITS和tef-1序列及生理特性方面具有相似性。虽然该种与T.lutea相关，但是形态特征更接近T.inhamatum，因此，仍然被认为是异源的种类。该种是目前发现能够产生trichothecences和alamethicins的唯一种类。

Overton（2006）修订了那些无性型属于 Hypocreanum组的分类单元。H.citrina和H.pulvinata组成了一个明显的进化枝，H.sulphurea是该进化枝的姐妹枝，关系更远的是H.subsulphurea，以及完全独立进化的Protocrea（现为Hypocrea）farinosa和H.megalocitri-na。因此，Hypocreanum组是异源性的，但尚不肯定这些无性型形态属于原始状态下自然存在的还是后续培养衍生而来的。在形态种T.koningii中，Samuels（2006）划分了12系统发育种，分布在3个谱系中：①T.koningii，T.ovalisporum+分布广泛的 T.koningiopsis等；②T.rogersonii+T.austrokoningii；③T.stilbohypoxyli。地理系统发育趋向在上述某些种类中有所表现。该项研究解决了T.koningiopsis的分类地位，该种是生物防治的重要种类。

2008年，Degenkolb等运用rpb2，tef1和ITS1，5.8 S及ITS2区域的序列分枝技术，结合形态学和代谢产物的化学分析手段，建立了Trichoderma brevicompactum进化枝，该进化枝与以前建立的Lutea进化枝关系最近。该枝成员包括 T.brevicompactum，T.arundinaceum，T.trrrialbense，T.protrudens和Hypocrea rodmanii。除了H.rodmanii外，所有成员均可产生单端孢烯类毒素Harzianum A或者木霉素Trichodermin，均产生肽醇类抗生素，包括alamenthin。T.viridescens被认为是一个种类复合体，Jacklitsch等（2013）通过增加ATP柠檬酸水解酶（acl1）基因分析，结合tef1和rpb2基因序列，建立了12个系统发育种：T.viridescens s.str.，T.paraviridescens，T.olivascens，T.viridarium，T.virilente，T.trixiae，T.viridialbum，T.appalachiense，T.neosinense，T.composticola，T.nothescens和T.sempervirentis。

1.3.1.5 其他分析技术

根据产生次生代谢产物的特征对木霉进行鉴别分类。如Thrane等（2001）利用高效液相色谱法进行全色谱矩阵的色谱图像分析，对44株木霉进行分类的结果与形态学分类及rDNA序列分析结果一致，该研究表明，木霉产生的次生代谢产物含有的信息足够用于木霉的分类鉴别。针对利用质谱对木霉进行的分类也有报道。Respinis等（2010）利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术对木霉蛋白质组或肽质量指纹进行分析，将129个木霉菌株划分为8个系统发育进化枝上25个不同种类，结果除T.saturnisporum（Longibrachiatum进化枝）和T.harzianum（Harzianum进化枝）外，能粗略证实此前分枝及分组方式。