细胞培养出现问题了怎么办

不动的小黑点：
1.破碎的细胞核。细胞刚经复苏，环境变化和胰酶消化过重，都会引起细胞大量的凋亡和状态变差，会使细胞核裂解出来，形成大量的小黑点，这样的小黑点不影响细胞的生长。细胞裂解物部分是可以贴壁的。新手技术有限，细胞传代时间过长或者胰酶处理时间过久，操作不够轻柔，都可能会引起这个问题。所以，我准备下次减低胰酶消化时间并尽量小心操作，勤换液，期待能有所好转。还有情况说是细胞放进抚育箱时瓶口没有松到一定程度。
2.血清灭活不彻底。高温处理影响血清的质量，而造成细胞生长进度降低，热处理的血清，沉淀物的形成会明显的增多。因为我用的是王牌GIBICO，如果分装过程无污染的话，这个是不用担心的。
3.第一种是你的培养基的问题，配培养基时最好选择孔径小的滤膜或者增加过滤次数。
第二种是因为同一培养瓶培养次数多了之后，死细胞的沉淀。解决方法是换新培养瓶。
4.传说中的黑胶虫？没经证实过，如细胞增殖不受影响，不考虑。
布朗运动，可增殖的小黑点，细胞大量凋亡：
3.细胞受到污染，首先排除细菌，细菌污染会引起培养液变浑浊，或长白色丝状物；其次，衣原体和支原体，细胞培养液澄清，但细胞增殖明显减慢；白色念珠菌，低倍镜下呈黑色，高倍镜下呈串珠样，但繁殖不快，一旦染上，细胞状态变差。
污染的影响：一些污染是这样的，微生物会合细胞竞争营养物质，当细胞状态好的时候，它们增殖很慢，一般不明显，一旦细胞不能及时换液，它们就开始有机可趁，细胞大量死亡。这些感染并非持续出现，是不稳定的，感觉和一些操作细节有关。

细胞培养最关键的还是操作，如果操作规范的话，污染几率是很小的，如果在培养的时候总是有黑色点状物质，可以考虑是不是细胞碎片或者血清里的蛋白质沉淀。

细胞污染可能原因：
1.天气太热，实验者在培养和接种或者换液时出汗（有空调稍好，但是手也出汗）。
2.培养间里可能暗藏污染原。
3.注意培养箱（这点最重要），仔细检查培养箱里的隔板的下面，有可能有霉菌斑。（我以前遇到过）
4.培养基污染多数是配置过程中造成的，仔细检查配置过程用到的器具。
5.血清过期一个月，如果保存的好应该没有问题，但是保存不好，新来的血清，用一次就可能污染。血清过期和污染是否有必然的联系不好说，我们觉得联系不大。

解决办法：
1.彻底清洁培养间，显微镜室。然后，紫外灯多照射一端时间消毒空气。
2.彻底清洁培养箱：（1）每个隔板仔细清洗，火烤。（2）培养箱大换水，换成新鲜干净的蒸馏水。（3）培养箱内壁用酒精棉球或者稀过氧乙酸认真擦洗。（4）紫外灯长时间照射（一天）。
3.实验用器械消毒：注意消毒时间和压力，有必要检查压力锅和校正压力表是否准确。
4.一次性手套在打开使用前一天放入无菌间照射消毒。
5.如果用双抗，应该现用现配。
6.注意过滤器的消毒灭菌。
7.经验告诉我们过期1年内的血清，只要保存妥当，其实血清的效价是不会降低的；还有刚购买的大规格的血清收到后，避免反复冻融，血清分装的时候要无菌分装，转入无菌间，在超净台内将血清分装入50-100ml血清瓶中封口，并于-20℃保存备用。分装时注意：① 预先要将血清轻轻摇动数周、混匀；② 用吸液管吹出血清时要注意：③ 不要吹出气泡，血清很粘稠，很容易产生气泡。如果产生气泡，则在酒精灯火焰上过一下。
8.检查培养间和超净台的通风过滤网，如果脏了，需要更换。

细胞培养过程中会出现一些问题，比如：细胞无法在培养皿上贴壁生长，细胞生长缓慢，细胞死亡等。那么该如何解决呢？
一、细胞无法在培养器皿上贴壁生长
1.细胞胰酶消化过度：缩短胰酶消化时间或减少胰酶用量。
2.支原体污染：隔离细胞，检测是否感染支原体；清洗通风厨和培养箱，如细胞被污染，灭菌处理后丢弃。
3.培养基中无附着因子：如果使用的是无血清配方，应确保含有附着因子或者使用经过包被的培养板。
二、细胞生长缓慢
1.培养基或血清改变：比较不同培养基配方中葡萄糖、氨基酸及其他成分有无差异；通过生长实验比较新老批次血清有无差异；增大细胞初始接种密度；使细胞逐步适应新的培养基。
2.必需生长促进成分（如L-谷氨酰胺或生长因子）耗竭、缺乏或分解：去除原培养基，加入新鲜培养基；向培养基中添加生长促进成分（如L-谷氨酰胺）。
3.轻度细菌或真菌污染：在不添加抗生素的条件下进行培养，如细胞被污染，灭菌处理后丢弃。
4.时间存储不当：血清应于-5℃至-20℃下储存；培养基应于2℃~8℃下避光储存；尽量减少血清和培养基见光时间。
5.细胞初始接种密度低：增大活细胞接种密度。
6.细胞衰老、老化：将老化细胞丢弃，取用代数较少的细胞。
7.支原体污染：隔离细胞，检测是否感染支原体；清洗通风厨和培养箱，如细胞被污染，灭菌处理后丢弃。
三、培养基pH值变化迅速
1.培养箱CO2分压设置错误：根据培养基中NaHCO3的浓度增大或降低培养箱CO2的分压，NaHCO3浓度为2.0-3.7g/L时，应相应地使用5%-10%的CO2分压。
2.细胞培养瓶瓶盖过紧：将瓶盖旋松1/4圈。
3.碳酸氢盐缓存系统缓冲能力不足：加入HEPES缓冲液，使其终浓度为10-25mM。
4.培养基中盐含量不正确：CO2平衡环境中使用以Earle平衡盐为基础的培养基，大气条件下使用以Hanks平衡盐为基础的培养基。
5.细菌、酵母或真菌污染：将细胞和培养基灭菌处理后丢弃。
四、细胞凋亡
1.培养箱中无CO2：监测培养箱中CO2使用速度以便确定及时更换气瓶；经常检测管路连接处是否漏气；不要频繁开启培养箱门。
2.培养箱内温度有波动：监测培养箱内温度，及时校正。
3.使用抗生素达到毒性浓度：减少抗生素的用量；使用无血清培养基时，抗生素浓度应降低至1/10。
4.细胞复苏或冻存时受到损伤：取用新的细胞。
5.培养基的渗透压不合适：检查完全培养基的渗透压。大多数哺乳动物细胞可耐受260~350mOsm/kg的渗透压，加入某些试剂和药物后会影响培养基的渗透压；昆虫细胞培养基的渗透压（340~380mOsm/kg）要高于哺乳动物细胞。
6.培养基中毒性代谢产物蓄积：去除原培养基，换用新鲜培养基。
五、悬浮细胞集成团
1.存在钙离子和镁离子：用不含钙离子和镁离子的平衡盐溶液清洗细胞，轻轻吹打细胞，使其形成单细胞悬液。
2.支原体污染：隔离细胞，检测是否感染支原体；清洗通风厨和培养箱，如细胞被污染，灭菌处理后丢弃。
3.蛋白水解酶消化过度导致细胞裂解、DNA释放：用0.001%DNA酶I处理细胞；用PBS冲洗后再接种到新培养基中。
文章链接：中国安防展览网 http://www.afzhan.com/company_news/Detail/171039.html