单细胞测序注意事项必读
kuaidi.ping-jia.net 作者：佚名 更新日期：2024-06-28
1. 组织样本经过解离变成细胞悬液，失去了空间位置信息，需要联合空间转录组等技术定位位置信息；
2. 组织样本经过组织保存、运输、酶解、裂红、去死等一系列实验操作，细胞中基因表达受到外界环境的应激反应偏离原来状态；
3. 不同细胞类型在组织消化过程中解离下来的难易程度不一，单细胞测序分析得到的细胞类型占比未必反应出实际占比，甚至有些细胞无法被解离消化下来或者细胞过于脆弱在解离和捕获实验中发生死亡；例如肝脏组织肝实质细胞以及血液中的粒细胞；
4. 不同实验批次的样本、解离方法和实验操作的差异引起的批次效应，与个体异质性带来的差异难以区分，依赖于人为主观经验判断是否需要去除批次，去除批次的方法选择因人而异，服务公司经常选择固定CCA或者MNN等常规方法；
5. 不同组织类型的样本、不同病理状态的样本、不同个人来源的样本，不同取样位置的样本，在相同的消化条件效果差异较大，往往解离活性低的样本不会选择上机，因此成功上机的样本都是经过活性标准的筛选，最终得到的结果存在幸存者偏差；
6. 经过组织酶解消化产生的细胞碎片和游离RNA产生严重的背景干扰，虽然通过去死、离心和流式分选等方法降低背景噪音，但增加较为繁琐的实验操作，是否有更为简单的去处背景噪音的办法；
7. 针对少量珍贵细胞样本(比如穿刺样本，数千个细胞），在目前的微流控和微孔板技术平台需要承担较大失败风险直接上机，并且细胞捕获效率基本在30~60%，是否有更高细胞捕获效率的方法；
8. 高通量单细胞测序检测到3`端转录本，只有基因表达定量信息，无法得到基因结构变异信息；可以通过三代全长建库测序的方法解决可变剪切和融合基因的分析。
9. 高通量单细胞测序在基因检测灵敏度较低，只能检测细胞表达全部基因的top 10%~30%，表达丰度低的基因无法检出，并且在不同细胞中存在gene dropout现象，可能会出现你所关注的目标基因几乎没有检出的问题；基因检出效率理论上越高越好，落实到具体的研究中满足自己的研究目的即可；
10. 单细胞测序数据解析最终还是落实到细胞群或者亚群的分析层面上，因此得到的基因表达矩阵经过降维聚类进行细胞分群，根据基因表达经典marker以及signature gene set推断出细胞类型和细胞亚型，细胞大类的经典marker相对特异，还有一些细胞类型没有特异性的marker， 例如髓系中marophage/monocyte/DCs等细胞类型区分，T和NK之间区分，无法依赖某一个经典marker gene，就依赖于signature gene set（特征基因集）, 但特征基因集在不同组织类型中各异，没有统一的标准，例如T细胞的亚群，分群层次和分群属性没有定论，不同研究根据研究目的需要自行决定；期待将来能够有完善权威的细胞图谱，给出更全面的细胞类型和细胞状态的图谱数据，并制定出科学普适的细胞分类标准；
11. 单细胞单一组学数据在某些细胞异质性解析和机制阐述方面也有无能为力的时候，可以选择结合上下游组学技术如蛋白、表观遗传等其他组学技术进行多组学联合；
12. 目前单细胞捕获的技术有较高比例的多细胞捕获问题，捕获1万个细胞，甚至能达到10%以上的多细胞捕获率，必须结合软件和手动鉴定的方式同时去除
13. 技术平台由于孔径限制对于细胞尺径大小有要求，一般要求在40um以下，对于肌肉细胞、脂肪细胞、神经元细胞等较大尺径细胞无法直接捕获，可以通过抽提细胞核的方法进行单细胞研究；
14. 单细胞测序数据的标准分析内容只是半成品，必须经过细胞类型鉴定、细胞状态判定、轨迹推断和通路富集等一系列探索性、个性化以及反复调整的数据挖掘过程，才有可能得到符合实验目的的新发现；而且在这个数据挖掘过程中非常依赖经验积累养成的主观判断、不断阅读学习文献和不懈的探索深入；
15. 涉及单细胞方案一定要提前做好文献调研工作，提前了解所要研究的样本类型的细胞组成，目标研究细胞类型是什么？目标细胞的数量占比多少？目标细胞是否需要富集，选择哪种方法富集，用何种方法解离，如何设计对照和比较组别，样本量多少合适，用何种单细胞平台技术，需要测多少数据量等等问题；
单细胞测序注意事项必读
答：14. 单细胞测序数据的标准分析内容只是半成品，必须经过细胞类型鉴定、细胞状态判定、轨迹推断和通路富集等一系列探索性、个性化以及反复调整的数据挖掘过程，才有可能得到符合实验目的的新发现；而且在这个数据挖掘过程中非常依赖经验积累养成的主观判断、不断阅读学习文献和不懈的探索深入；15. 涉及单细胞方案...
单细胞测序| 数据预处理常见问题
答：在实际操作中，判断批次效应的程度并选择合适的矫正方法，是一项主观但需要精准的任务。Seurat3的矫正效果可以通过图4进行比较，尽管难以确定理想状态，但后续分析中要不断评估矫正是否恰到好处。单细胞测序的探索永无止境，基迪奥7月的在线培训班，将全方位覆盖技术、项目、数据挖掘和绘图等领域，期待你的参...
单细胞RNA系列专题之一:单细胞RNA测序中质控之重要细节 (上篇)_百度...
答：我们在做单细胞测序的时候，首先要做细胞分离。细胞分离必须要在短时间内完成，否则会影响到细胞的状态，甚至可能导致RNA从细胞中漏出。从组织中分离出细胞往往很困难，具体方法可以参考《Tissue Handling and Dissociation for Single-Cell RNA-Seq》这本书。这里总结一下从组织中分离出单细胞可能遇到的问题...
单细胞RNA系列专题之一:单细胞RNA测序中质控之重要细节 (下篇)_百度...
答：单细胞RNA测序最棘手的就是批次效应（batch effect）。 batch effects 可以发生在：不同批次的样品或许采用的质控标准也应该不一样，通过PCA的结果，可以查看结果中是否有明显的批次效应。
单细胞转录组测序知识一隅
答：具体的实验流程如图所示，最终含有细胞的油滴占所有油滴比例大约5%，更好地保证了含有细胞的油滴里面只有1个细胞，一个包含细胞的油滴内就是一个单细胞scRNA-Seq。每个GEMs内包含独特的10X barcode用于区分不同的单细胞；每个GEMs内相同的10X barcode与不同的UMI组成用于区分不同转录本的Gel Bead poly(...
前沿技术| 单细胞测序技术小讲
答：传统的基因测序方法（Bulk RNA-seq）是对组织进行的检测，得到的结果是所有细胞的平均值，会忽略细胞之间的差异性，比如有的细胞转录水平比较高，有的细胞则比较低。同时如果目标细胞占比本来稀少，则这些细胞的信息会被平均或覆盖掉。 单细胞测序技术很好的解决了bulk RNA-seq的问题，可以...
实用干货|单细胞测序组织保存液那些事
答：运输时间须在48小时内，然后开展实验；百奥医药具有丰富单细胞测序经验，已完成大量的组织保存液储存样本的细胞悬液制备实验，并得到高质量的单细胞悬液结果。1.组织保存液保存24h-48h的穿刺癌组织细胞悬液制备结果 2.组织保存液保存＜24h的穿刺癌组织细胞悬液制备结果 王俊杰、李超 | 文案 ...
一文看懂植物单细胞测序怎么做?
答：单细胞测序的数据可以结合CHIP-seq的对转录因子的鉴定或者survey对染色体状态的研究,以得到更完善的基因表达的信息。 文章利用10xGenomics scRNA-seq技术优化了一个方案,生成了玉米穗花序发育的高分辨率转录组图谱,进一步构建了转录调控网络,并确立与玉米穗产量性状相关的候选基因。 植物的单细胞图谱构建的两大挑战,其中...
标准化单细胞RNA测序数据—陷阱和建议
答：单细胞RNA测序(scRNA-seq)的目的通常是亚群鉴定和差异基因表达分析。 为避免“维度灾难”(curse of dimensionality),将高可变基因 (HVG) 用于聚类分析。 多项研究表明,HVG对原始计数矩阵标准化方法的选择很敏感。 原始read计数不能直接用于比较细胞之间的基因表达,因为它们会被实验技术和“无趣”的生物变异所混淆(干扰...
2. 组织样本经过组织保存、运输、酶解、裂红、去死等一系列实验操作，细胞中基因表达受到外界环境的应激反应偏离原来状态；
3. 不同细胞类型在组织消化过程中解离下来的难易程度不一，单细胞测序分析得到的细胞类型占比未必反应出实际占比，甚至有些细胞无法被解离消化下来或者细胞过于脆弱在解离和捕获实验中发生死亡；例如肝脏组织肝实质细胞以及血液中的粒细胞；
4. 不同实验批次的样本、解离方法和实验操作的差异引起的批次效应，与个体异质性带来的差异难以区分，依赖于人为主观经验判断是否需要去除批次，去除批次的方法选择因人而异，服务公司经常选择固定CCA或者MNN等常规方法；
5. 不同组织类型的样本、不同病理状态的样本、不同个人来源的样本，不同取样位置的样本，在相同的消化条件效果差异较大，往往解离活性低的样本不会选择上机，因此成功上机的样本都是经过活性标准的筛选，最终得到的结果存在幸存者偏差；
6. 经过组织酶解消化产生的细胞碎片和游离RNA产生严重的背景干扰，虽然通过去死、离心和流式分选等方法降低背景噪音，但增加较为繁琐的实验操作，是否有更为简单的去处背景噪音的办法；
7. 针对少量珍贵细胞样本(比如穿刺样本，数千个细胞），在目前的微流控和微孔板技术平台需要承担较大失败风险直接上机，并且细胞捕获效率基本在30~60%，是否有更高细胞捕获效率的方法；
8. 高通量单细胞测序检测到3`端转录本，只有基因表达定量信息，无法得到基因结构变异信息；可以通过三代全长建库测序的方法解决可变剪切和融合基因的分析。
9. 高通量单细胞测序在基因检测灵敏度较低，只能检测细胞表达全部基因的top 10%~30%，表达丰度低的基因无法检出，并且在不同细胞中存在gene dropout现象，可能会出现你所关注的目标基因几乎没有检出的问题；基因检出效率理论上越高越好，落实到具体的研究中满足自己的研究目的即可；
10. 单细胞测序数据解析最终还是落实到细胞群或者亚群的分析层面上，因此得到的基因表达矩阵经过降维聚类进行细胞分群，根据基因表达经典marker以及signature gene set推断出细胞类型和细胞亚型，细胞大类的经典marker相对特异，还有一些细胞类型没有特异性的marker， 例如髓系中marophage/monocyte/DCs等细胞类型区分，T和NK之间区分，无法依赖某一个经典marker gene，就依赖于signature gene set（特征基因集）, 但特征基因集在不同组织类型中各异，没有统一的标准，例如T细胞的亚群，分群层次和分群属性没有定论，不同研究根据研究目的需要自行决定；期待将来能够有完善权威的细胞图谱，给出更全面的细胞类型和细胞状态的图谱数据，并制定出科学普适的细胞分类标准；
11. 单细胞单一组学数据在某些细胞异质性解析和机制阐述方面也有无能为力的时候，可以选择结合上下游组学技术如蛋白、表观遗传等其他组学技术进行多组学联合；
12. 目前单细胞捕获的技术有较高比例的多细胞捕获问题，捕获1万个细胞，甚至能达到10%以上的多细胞捕获率，必须结合软件和手动鉴定的方式同时去除
13. 技术平台由于孔径限制对于细胞尺径大小有要求，一般要求在40um以下，对于肌肉细胞、脂肪细胞、神经元细胞等较大尺径细胞无法直接捕获，可以通过抽提细胞核的方法进行单细胞研究；
14. 单细胞测序数据的标准分析内容只是半成品，必须经过细胞类型鉴定、细胞状态判定、轨迹推断和通路富集等一系列探索性、个性化以及反复调整的数据挖掘过程，才有可能得到符合实验目的的新发现；而且在这个数据挖掘过程中非常依赖经验积累养成的主观判断、不断阅读学习文献和不懈的探索深入；
15. 涉及单细胞方案一定要提前做好文献调研工作，提前了解所要研究的样本类型的细胞组成，目标研究细胞类型是什么？目标细胞的数量占比多少？目标细胞是否需要富集，选择哪种方法富集，用何种方法解离，如何设计对照和比较组别，样本量多少合适，用何种单细胞平台技术，需要测多少数据量等等问题；
答：14. 单细胞测序数据的标准分析内容只是半成品，必须经过细胞类型鉴定、细胞状态判定、轨迹推断和通路富集等一系列探索性、个性化以及反复调整的数据挖掘过程，才有可能得到符合实验目的的新发现；而且在这个数据挖掘过程中非常依赖经验积累养成的主观判断、不断阅读学习文献和不懈的探索深入；15. 涉及单细胞方案...
答：在实际操作中，判断批次效应的程度并选择合适的矫正方法，是一项主观但需要精准的任务。Seurat3的矫正效果可以通过图4进行比较，尽管难以确定理想状态，但后续分析中要不断评估矫正是否恰到好处。单细胞测序的探索永无止境，基迪奥7月的在线培训班，将全方位覆盖技术、项目、数据挖掘和绘图等领域，期待你的参...
答：我们在做单细胞测序的时候，首先要做细胞分离。细胞分离必须要在短时间内完成，否则会影响到细胞的状态，甚至可能导致RNA从细胞中漏出。从组织中分离出细胞往往很困难，具体方法可以参考《Tissue Handling and Dissociation for Single-Cell RNA-Seq》这本书。这里总结一下从组织中分离出单细胞可能遇到的问题...
答：单细胞RNA测序最棘手的就是批次效应（batch effect）。 batch effects 可以发生在：不同批次的样品或许采用的质控标准也应该不一样，通过PCA的结果，可以查看结果中是否有明显的批次效应。
答：具体的实验流程如图所示，最终含有细胞的油滴占所有油滴比例大约5%，更好地保证了含有细胞的油滴里面只有1个细胞，一个包含细胞的油滴内就是一个单细胞scRNA-Seq。每个GEMs内包含独特的10X barcode用于区分不同的单细胞；每个GEMs内相同的10X barcode与不同的UMI组成用于区分不同转录本的Gel Bead poly(...
答：传统的基因测序方法（Bulk RNA-seq）是对组织进行的检测，得到的结果是所有细胞的平均值，会忽略细胞之间的差异性，比如有的细胞转录水平比较高，有的细胞则比较低。同时如果目标细胞占比本来稀少，则这些细胞的信息会被平均或覆盖掉。 单细胞测序技术很好的解决了bulk RNA-seq的问题，可以...
答：运输时间须在48小时内，然后开展实验；百奥医药具有丰富单细胞测序经验，已完成大量的组织保存液储存样本的细胞悬液制备实验，并得到高质量的单细胞悬液结果。1.组织保存液保存24h-48h的穿刺癌组织细胞悬液制备结果 2.组织保存液保存＜24h的穿刺癌组织细胞悬液制备结果 王俊杰、李超 | 文案 ...
答：单细胞测序的数据可以结合CHIP-seq的对转录因子的鉴定或者survey对染色体状态的研究,以得到更完善的基因表达的信息。 文章利用10xGenomics scRNA-seq技术优化了一个方案,生成了玉米穗花序发育的高分辨率转录组图谱,进一步构建了转录调控网络,并确立与玉米穗产量性状相关的候选基因。 植物的单细胞图谱构建的两大挑战,其中...
答：单细胞RNA测序(scRNA-seq)的目的通常是亚群鉴定和差异基因表达分析。 为避免“维度灾难”(curse of dimensionality),将高可变基因 (HVG) 用于聚类分析。 多项研究表明,HVG对原始计数矩阵标准化方法的选择很敏感。 原始read计数不能直接用于比较细胞之间的基因表达,因为它们会被实验技术和“无趣”的生物变异所混淆(干扰...
