单细胞RNA系列专题之一：单细胞RNA测序中质控之重要细节 （下篇）
单细胞RNA测序是目前的一大热门。通过单细胞RNA测序，能够带给我们原来 bulk RNA 测序所得不到的信息，对于研究发育生物学，肿瘤生物学，免疫等有着极其重要的价值。
单细胞测序的核心就是t-SNE降维，以及聚类。那么在做这些工作之前的质控，关乎到整个分析的成败。这篇文章我就继续给大家讲讲单细胞质控的那些事儿。
整个单细胞分析的核心其实就是确定cell types/ lineages。而在此之前的一步就是数据质控(QC, quanlity control)。我们在得到表达矩阵之后，会做Data normalization , 基因集筛选，批次效应的去除等工作；之后用PCA， t-SNE进行降维。如果在这一过程中发现了一些问题，我们会移除掉一些细胞，然后重新质控，降维分析。
一般而言，检查点有如下一些：
比对率比较低或者reads数较少有可能是建库原因。reads数较少可能与形成较多的primer dimer有关，而比对率低通常是建库的原因。
如果spike-in RNA序列很少，那么就可以直接说明是建库失败。如果spike-in 正常，但细胞RNA序列较少，可能是因为这个细胞本身就非常小，或者细胞在建库前出现了破损。
检测出基因的数量与细胞大小直接相关。如果检测出的基因（UMI）过多，很有可能是这个droplet里面有多个细胞，但是也不能排除是这个细胞就是非常的大。如下图，基因数目过多或者过少，都是不正常的情况。
通常而言，细胞大小、spike-in RNA比例与检测出的基因数往往是正相关的，如下图。
如果线粒体RNA过高，也同样预示着细胞有破损。因为当细胞破损时，细胞质RNA会跑出来，但是线粒体RNA由于有线粒体膜的包裹，不会溢出。因此，当细胞膜有破损时，线粒体RNA所占比例会很高。注意：当细胞出现apoptosis, necrosis的时候，也会有这种现象。
核糖体RNA占比较高时，可能是因为细胞内出现了较多的RNA降解。在全长单细胞转录组中，3’ 偏好性可用于检测细胞内是否存在大量RNA降解。
在上图中，我们对细胞中基因的数量、唯一比对率、基因body比对率、spike_detection等绘制分布图，然后剔除不合格细胞，将能够通过上述所有质控标准的细胞保留下来、用于后续分析。
基于PCA这一算法也可以进行质控，找到明显没有与其他细胞聚到一起的细胞。这些细胞被认为是质控不达标的细胞，如下图所示。
我们已经有了这么多方法和指标去过滤细胞，那么我们需要注意一些什么呢？
接下来就是要讨论如何过滤基因，对于绝大多数情况，我们不会用所有的基因去进行降维分析，所以需要进行基因集合的选取。
基因集的设定是基于：
（1）表达量高于一定阈值的基因
（2）在整个细胞样本中存在差异变化的基因
（3）用先验的知识去挑选基因
（4）bulk RNA测序中已经鉴定出来的差异基因。
（5）t-SNE降维时只选取前几个PC
有些时候，有些基因的表达异常高，这对后续数据的Normalization带来影响，有时也会考虑过滤掉。比如nulcear lncRNA ,、actin,、hemoglobin,、线粒体RNA和核糖体RNA。
有一些基因要根据情况需要进行移除，以下三点要根据课题情况来决定是否保留或者去除。
单细胞RNA测序最棘手的就是批次效应（batch effect）。 batch effects 可以发生在：
不同批次的样品或许采用的质控标准也应该不一样，通过PCA的结果，可以查看结果中是否有明显的批次效应。
答：蓝海大脑生命科学冷冻电镜工作站研究人员表示：单细胞 RNA 测序（Single cell RNA sequencing，scRNA-seq）是一种在单细胞水平上利用 RNA 测序对特定细胞群体进行基因表达谱定量的高通量实验技术。待测组织经过单细胞分离、RNA 提取、逆转录、文库构建和测序，便可利用数据分析获得多个细胞的基因表达谱。1....
答：根据所使用的文库制备方法，RNA序列(也称为读序列或标签)将从转录本的3端(或5端)(10X Genomics, cell -seq2, Drop-seq, inDrops)或全长转录本(Smart-seq)中获得。针对感兴趣的生物学问题选择不同的方法。下面列出了这些方法的优点：3 '端测序与全长测序需要进行许多相同的分析步骤，但 3' 端...
答：单细胞RNA测序(scRNA-seq)的目的通常是亚群鉴定和差异基因表达分析。 为避免“维度灾难”(curse of dimensionality),将高可变基因 (HVG) 用于聚类分析。 多项研究表明,HVG对原始计数矩阵标准化方法的选择很敏感。 原始read计数不能直接用于比较细胞之间的基因表达,因为它们会被实验技术和“无趣”的生物变异所混淆(干扰...
答：现在我们已经整合了高质量的细胞，我们想知道我们的细胞群中存在的不同细胞类型。目标：挑战：建议：在开始本课程之前，让我们命名为 clustering.R .首先加载我们需要的所有库。为了克服 scRNA-seq 数据的任何单个基因表达中的广泛技术噪音， Seurat 根据来自整合的最可变基因的表达的 PCA 分数将细胞分配到...
答：AUCell可以识别单细胞RNA序列数据中具有活跃基因集(例如signatures,基因模块...)的细胞。 AUCell使用“曲线下面积”(AUC)来计算输入基因集的关键子集是否在每个细胞的表达基因中富集。 AUC分数在所有细胞中的分布允许探索特征的相对表达。 由于计分方法是基于排名的,因此AUCell不受基因表达单位和标准化程序的影响。 此外...
答：单细胞测序技术是指 在单个细胞水平上 ，对基因组、转录组、表观组等进行高通量测序分析的一项新技术。它能够揭示 单个细胞的基因结构和基因表达状态 ，反映 细胞间的异质性 ，在肿瘤学、发育生物学、免疫学、神经科学等领域发挥着重要作用。单细胞RNA-seq顾名思义就是单个细胞进行转录组测序，那么什么...
答：一文了解单细胞对象数据结构/数据格式，单细胞数据操作不迷茫。本文内容包括 单细胞seurat对象数据结构， 内容构成，对象的调用、操作，常见函数的应用等。默认情况下，我们是对Seurat中的RNA的Assay进行操作。可以通过 @active.assay 查看当前默认的assay，通过 DefaultAssay() 更改当前的默认assay。 结构 ...
答：每种方法都有各自的优缺点,但一般说来,迄今为止发展起来的所有scrna-seq技术都共享一个共同的工作流程:样品制备、单细胞捕获、反转录和扩增、文库制备、测序和分析[3]。 1、样本制备(分离细胞) 单细胞RNA测序的一般实验工作流程始于将感兴趣的器官或组织解离。充分的样本准备是产生良好的单细胞转录组数据的先决...
答：欢迎关注同名公主号： BBio 10X也是基于此文献的，考古一下，学习区分空载和真实细胞大体思路。当时已经存在的一些方法会假设含有细胞的GEMs会有更高的UMI总数，并以UMI数目指标筛选细胞，但是这种方法难以区分本就存在的小细胞和空载。文章开发了一种新方法，首先评估ambiant RNA的表达特征，然后检验每个...
答：这要看你引物设计如何了，跨内含子与否。。？如果引物设计的好，DNA污染对反转录是没有任何影响的。。不过还是建议你用DNA酶消化一下。。北京华越洋的RNA提取试剂盒，在RNA提取过程中清楚了DNA污染，所以得到的RNA没有任何DNA污染，可满足苛刻的荧光定量PCR对DNA无残留的要求。。北京华越洋生物。。外源RNA...
