标准化单细胞RNA测序数据—陷阱和建议
博文名称：Normalizing single cell RNA sequencing data — Pitfalls and Recommendations
博文链接： https://towardsdatascience.com/normalizing-single-cell-rna-sequencing-data-pitfalls-and-recommendations-19d0cb4fc43d
博文发表时间：Jan 29, 2020
单细胞RNA测序(scRNA-seq)的目的通常是亚群鉴定和差异基因表达分析。 为避免“维度灾难”（curse of dimensionality），将高可变基因 (HVG) 用于聚类分析。 多项研究表明，HVG对原始计数矩阵标准化方法的选择很敏感。
原始read计数不能直接用于比较细胞之间的基因表达，因为它们会被实验技术和“无趣”的生物变异所混淆（干扰）。 通过QC质控步骤和其他方法可用于过滤和回归无趣的生物变异。 虽然PCR扩增偏差通常可以通过使用唯一分子标识符 (UMI) 来处理，但需要标准化以消除其他技术引起的变异，如测序深度、细胞裂解和逆转录效率的差异。
标准化（Normalization）处理的主要目标是消除技术效应的影响，同时保留真正的生物学异质性。在标准化处理良好的数据集中，一个基因的方差应该与细胞的基因丰度和测序深度无关。 “真正”差异表达的基因应该在不同细胞类型之间表现出高差异，而看家基因应该表现出低差异。
因此，标准化是一个关键的预处理步骤，它会极大地影响scRNA分析的下游应用。 不幸的是，scRNA数据集通常沿用从bulk RNA-seq继承的方法进行标准化，但是，由于技术性质的差异和这些数据集的固有复杂性，我们很快就会看到这些方法是不合适的。
在这篇博文中，我们将看到全局缩放方法（global scaling methods）在scRNA-seq分析中的局限性。 我们还将讨论最近推出的SCNorm和SCTransform归一化方法的潜力优势，这些方法专为单细胞分析量身定制。
传统上，使用RPKM（每千碱基百万读取数）、FPKM（每千碱基百万片段）或 TPM（每百万转录本）方法将跨细胞的原始表达计数通过测序深度进行标准化。 要了解它们的工作原理，请观看此 视频 。 虽然这些方法适用于样本内标准化，但它们已广泛认为不适合样本之间的差异表达分析。
例如，考虑在两个处理条件—对照组和治疗组之间，比较两个基因A和 基因B的表达的情况。 基因A在两种处理下的表达水平相同，而基因B在处理组中细胞的表达水平高出2倍。 TPM归一化将绝对表达值转化为相对表达值，因此，我们可能会得出结论，如果基因B在两组间是差异表达的，那么基因A也是差异表达的。
基于基因集的方法为了解决全局缩放方法的固有问题，最近引入了两种有趣的归一化方法 - SCnorm (2017) 和 SCTransform (Seurat package v3, 2019)。
SCnorm 是 Bioconductor上的R包。 对于每个基因，SCnorm通过分位数回归（quantile regression）估计基因表达对测序深度的依赖性。 然后将具有相似依赖性的基因进行分组，并使用第二个分位数回归来估计每组的缩放因子（ scale factors）。 最后使用每个组特定的缩放因子调整每个基因集的测序深度，以生成标准化的基因表达估计。
单个细胞数据集（ Bacher et al ）中3个基因表达
A：原始计数与测序深度，B：标准化的全局缩放因子与测序深度，C：SCnorm计数与测序深度
上图显示来自单个样本的细胞数据集中三个基因的计数深度关系。 图 A 是未标准化或原始表达计数。 很明显，与图C 中的 SCnorm 相比，基于全局缩放因子的方法（图 B）在标准化方面做得很差。
SCTransform 是可用于Seurat v3的R包。 该方法使用正则化负二项式模型（regularized negative binomial model）对UMI计数进行建模，以消除因测序深度引起的变化。 简而言之，该方法首先使用测序深度作为自变量和UMI计数作为响应或因变量为每个基因构建广义线性模型 (GLM)。 然后根据基因表达对参数估计进行正则化（或调整）。 使用正则化参数应用第二轮负二项式回归。 该模型的输出（残差）是每个基因的标准化表达水平。
这里的关键信息是，SCnorm 和 SCTransform 方法都学习基因集（ gene-group ）特定的因素，而不是使用常数因子来标准化所有基因。 这些因素分别针对低、中和高表达基因，消除了技术变异的影响，同时保留了真正的生物异质性。
归一化方法的选择会影响高变异基因的选择，从而影响scRNA数据的所有下游分析。 直接将bulk RNA-seq的归一化方法应用于scRNA数据集是不合适的。 推荐通过选择SCNorm或SCTransform归一化方法来更新分析流程并充分利用最新的技术方法是值得的。
在RNA-Seq的分析中，对基因或转录本的read counts数目进行标准化（normalization）非常重要，因为落在一个基因区域内的read counts数目取决于基因长度和测序深度。一个基因越长，测序深度会越高，落在其内部的read counts数目就会相对越多。因此，我们使用相对测量，而不是绝对测量。
因此，我们需要标准化的两个关键因素就是基因长度和测序深度，常常用RPKM (Reads Per Kilobase Million), FPKM (Fragments Per Kilobase Million) 和 TPM (Transcripts Per Million)作为标准化数值。
计算RPKM主要包括以下三步：
其中：
FPKM与RPKM的计算过程相同，它们的区别是：RPKM用于单端测序结果，FPKM用于双端测序结果（如图2所示）。因为双端测序中，每一个fragment会包含两个reads，使用FPKM来计算基因的表达丰度时，可以避免把同一个fragment的两个reads计算两次（实际上只需要计算一次）。
单端read与双端read比对到基因组的示意图所示：
TPM与RPKM最大的区别在于消除两种影响的次序：在TPM中先消除基因长度的影响，再消除测序深度的影响。计算TPM的过程也可以分为三个步骤：
计算公式表示如下：
其中：
因为交换了两次计算的次序，TPM最终得到的结果中，每个样本总的TPM值是相同的，这样的结果便于样本间差异的比较。
有以下RNA-seq数据，测定了A、B、C、D四个基因，长度分别是2、4、1、10kb，共测定了3个生物重复：Rep1、Rep2、Rep3。
第一步，计算总Read数
由于只有4个基因，所以总Read数并没有太大，因此使用10模拟百万进行总read换算。
第二步：标准化总Read数
将Rep1、Rep2、Rep3除以各自换算后的总Read数（也就是3.5，4.5，10.6），得到RPM：
RPKM是先进行测序深度标准化，后进行基因长度标准化；而TPM是先进行基因长度标准化，后进行测序深度标准化 。事实证明，TPM的标准化方法更有优势，为何会这样，见后述。这里先看看TPM的计算。
第一步：进行基因长度标准化。先将基因A、B、C、D的Read数除以各自的基因长度（基因长度单位kb），得到RPK。
详见黄树嘉的《 为什么说FPKM和RPKM都错了 ？》
TPM的归一化考虑了基因长度和测序深度，而seurat的归一化没有考虑基因长度，只考虑了测序深度，为什么不需要考虑基因的长度？
每个归一化方法内在的考虑因素不相同，TPM考虑了基因长度，基因越长，落在基因序列上的reads数量也相应越多。
归一化还跟它要解决的问题相关。
10X官方也答复了该问题：
https://kb.10xgenomics.com/hc/en-us/articles/115003684783-How-to-calculate-TPM-RPKM-or-FPKM-instead-of-counts -
答：在10x Genomics基因表达分析中，每个转录本都标记有唯一的分子标识符（UMI）序列。这些UMI能够准确定量基因表达水平，因为我们可以判断哪些read是由相同的mRNA分子产生的。因此，Cell Ranger和Space Ranger执行UMI计数（非read计数）以测量基因表达水平，并且所有下游分析步骤均基于UMI计数执行。
传统的RNA-seq数据中，完整的转录本被片段化，随后是cDNA合成、末端修复和接头连接。在此实验流程中，从长转录本中提取fragment片段的概率高于从短转录本中提取的概率。因此，TPM、RPKM、FPKM通过转录本长度（基因的长度）对read计数进行标准化是有意义的。然而，在10x基因表达分析中，这种基因长度偏差并不存在。因此，我们不建议通过基因长度使UMI计数标准化。
10X单细胞测序的UMI标签，消除PCR扩增的偏好性；
参考：
https://www.plob.org/article/16013.html
https://www.cnblogs.com/Belter/p/13205635.html
https://www.jianshu.com/p/1940c5954c81?from=groupmessage
https://www.jianshu.com/p/35e861b76486
https://bioinfo.umassmed.edu/content/pdf2016fall/normalization.pdf
https://www.cnblogs.com/emanlee/p/14933354.html
答：想了解更多单细胞相关知识，点击查看： 1.单细胞转录组(Single cell RNA)概述 2.单细胞转录组亚群分析 3.单细胞转录组高级分析介绍 4.单细胞RNA系列专题之一：单细胞RNA测序中质控之重要细节 （上篇） 5.单细胞RNA系列专题之一：单细胞RNA测序中质控之重要细节 （下篇）10xGenomics单细...
答：Cell Ranger 是什么？Cell Ranger 是 10X genomics 官方提供的一套针对单细胞 RNA 测序输出结果进行比对、定量、聚类及基因表达分析的分析流程，它包含有与单细胞基因表达分析相关的四个pipelines，分别是：cellranger mkfastq 流程 ：其功能为将 Illumina 测序仪产生的 raw base call (BCL) 文件解析成 ...
答：深入解析神经/脑组织的奥秘，单细胞测序技术揭示了神经系统中隐藏的细微世界。这些精密技术如10× snRNA-seq，将我们带入一个个细胞层面的探索之旅，揭示了神经元和胶质细胞如何共同构建和调控复杂的生理功能。神经损伤的新视角</10× snRNA-seq测序揭示了141,093个细胞的动态，特别是神经损伤后的转录反应...
答：虽然这种归一化的方式很简单，但细胞文库大小归一化并不能解决高通量测序数据中经常出现的成分偏差，它也不能解释影响spike-in转录本产生的差异。我们强烈建议使用来自scran包的 computeSumFactors 和 computeSpikeFactors 函数来进行计算。批次效应的校正可以解决不同批次中细胞之间表达的系统差异，与比例偏差不...
答：因为组织可以直接从冻存状态开始抽核，此状态下细胞转录活动已经被抑制并固定，因此不会再发生转录状态改变，结果真实性提高。直接对细胞进行机械法或者化学法破碎，不会引入解离偏好性，理论上来讲所有细胞类型都能得到回收，能够获得更加完整和全面的细胞图谱。虽然有一些比较单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单...
答：单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 方法可以分析单细胞的转录组,但不能保留空间信息。 相反,空间转录组学 (ST) 分析可以描绘组织切片中的空间区域,但没有单细胞基因组分辨率。 在这里,作者开发了一种称为 CellTrek 的计算方法,它结合了这两个数据集来实现单细胞空间映射。 测试使用模拟研究和两个原位数据集对 Cell...
答：单细胞RNA测序(scRNA-seq)和DNA测序(scDNA-seq)都可以应用于细胞水平基因组分析。对于突变分析，scDNA-seq似乎更常见。然而，这项任务是非常具有挑战性的，只有两份拷贝DNA分子作为输入十分有限，而全基因组扩增则会产生偏差和其他技术噪音。scRNA-seq通常具有更大的数据量和更好的数据质量。但目前DNA...
答：甚至，如果关注点在细胞蛋白上，ADTs可以独立于细胞的mRNA而单独测序、分析，即已报到的Abseq。 4. CITE-seq能够与10X Genomics无缝衔接，方便易操作。参考： CITE-seq可以同时测细胞表面蛋白和RNA的单细胞测序 Total-seq的前世今生——前世：CITE-seq ...
答：使用的某些工具不是标准的工作流程工具,因此需要在方法中进行进一步说明 优点: 缺点: 由SARS-CoV-2引起的COVID-19最近影响了1,200,000多人,造成60,000多人丧生。关键的免疫细胞亚群发生变化,其在COVID-19过程中的状态仍不清楚。作者试图通过单细胞RNA测序技术全面表征COVID-19恢复期外周血单个核细胞的转录变化。
答：默认使用数据标准化方法是 LogNormalize , 每个细胞总的表达量都标准化到10000,然后log取对数;结果存放于 pbmc[["RNA"]]@data 。 #标准化前,每个细胞总的表达量 #标准化后,每个细胞总的表达量 ##4.3 变化基因鉴定 鉴定在细胞间表达高度变化的基因,后续研究需要集中于这部分基因。Seurat内置的FindVariableFeatures...
