植物体细胞杂交技术的过程

将植物细胞A与植物细胞B用纤维素酶和果胶酶处理，得到不含细胞壁的原生质体A和原生质体B，运用物理方法或是化学方法诱导融合，形成杂种细胞，再利用植物细胞培养技术将杂种细胞培养成杂种植物体。
①杂交时间：植物细胞杂交是从细胞融合开始，到培育成的新植物体结束。
a.原生质体制备：用酶解法去除细胞壁（纤维素酶和果胶酶）
b.原生质体融合：膜融合（高钙、高pH诱导融合）、核融合（杂种细胞第一次有丝分裂时融合）
原生质体的融合 1．PEG诱导融合法
 PEG诱导融合的特点：其优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较
高；融合过程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。
 PEG的作用机理： Kao等认为，由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极
性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在原生质体之间形成分子桥，其
结果是使原生质体发生粘连进而促使原生质体的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动
性，也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。
 融合技术要点：
融合液：CaCl2·2H2O 8~10mmol
KH2PO4 0.7mmol
甘露醇或山梨醇 0.5~1.0mol
pH 5.6
诱导液：融合液+PEG 20～45%
稀释液：A液（g/100ml）pH6.0 B液（g/100ml）pH10.5
葡萄糖7.21甘氨酸0.375
CaCl2·2H2O 0.79 NaOH 0.169
DMSO 10ml
2．电融合法
 与PEG融合比较起来，电融合有三大优点：一是不存在对细胞的毒害问题；二是融合效
率高；三是融合技术操作简便。
电融合仪的结构特点：一是交变电场部分；一是高频直流电击部分。
电融合的基本过程：
细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生
质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体
紧密接触排列成串；
P1 P2
P1 P2
混合静止1min.
融 合
融合液
加入PEG
稀 释洗 涤
加入稀释液
加入培养基
培 养
选 择
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第七章) 主讲教师：柳俊博士、教授
膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而
导致两个紧密接触的细胞融合在一起。
 关于融合参数：电融合中的主要参数包括交流电压、交变电场的振幅频率、交变电场的
处理时间；直流高频电压、脉冲宽度、脉冲次数等。 首先，原生质体质量对细胞的融合起着至关重要的作用，高质量的原生质体是细胞融合
的首要条件。
其次，融合方法
其三是融合参数，包括各种融合液都应选择适当。
c.方法：物理方法（离心、振动、电激）、化学方法（聚乙二醇（PEG））
d.杂种细胞的筛选和培养：机械法、生理法、遗传法
e.杂种细胞的再生和鉴定：由愈伤组织再培养出杂种植株的过程
杂种细胞的发育动态及体细胞杂种鉴定
一、杂种细胞的发育动态
核质重组
细胞器重组
部分核物质或细胞器丢失
核分裂的非同步性
二、体细胞杂种的特点
形态上的趋中性
变异幅度大
非整倍性
双亲性状的共显性
偏亲现象
三、杂种细胞的选择系统与杂种植株的鉴定
1．杂种细胞的选择系统
外观选择
 互补选择
 荧光标记选择
2．体细胞杂种的鉴定
 形态鉴定：根据双亲的形态学性状观察进行鉴定。
 细胞学鉴定：细胞器鉴定、染色体鉴定。
 生化鉴定：同功酶鉴定。
分子鉴定：RFLP鉴定、RAPD标记鉴定。
体细胞杂种的遗传特性
1．细胞分裂与染色体丢失
如果细胞分裂而核不发生融合，在以后的发育过程中就会有两种结果，一是细胞分裂
几次以后即停止生长从而导致死亡；二是在发育过程中某一亲本的细胞核部分或全部丢失。
如果这样就会产生几种情况：A细胞+B细胞质；A细胞+B细胞质和部分染色体或基因。
2．基因转移与性状表达
由于染色体的部分丢失，常常使某个亲本的部分或个别基因与另一亲本的染色体发生
整合，其结果是实现了亲本间的基因转移。基因转移通常是在后代中某些性状得以表达，有
时由于基因的重组也可能产生双亲均没有的新性状。
3．体细胞杂种遗传上的不稳定性
体细胞杂种后代在遗传上常常不稳定，这可能涉及到多方面的因素，如亲缘关系的远
近、培养过程中的染色体变异、细胞核、细胞质遗传物质的重组等。
②优点：克服远缘杂交不亲和的障碍，扩大杂交亲本范围，培育新优良品种。
③举例：“白菜-甘蓝”同白菜相比，具有生长期短，耐热性强，和易储藏等优点。