PCR克隆目的基因如何引入不同限制酶切点？

在目的基因制备中，cDNA文库PCR技术展现出独特的优点。相比于常规基因克隆方法，PCR技术以其快速和简便而著称。然而，它的局限性在于需要预先知道侧接靶序列的核苷酸序列以设计引物，这限制了其广泛应用。

为了克服这个局限，可以直接利用PCR产物，通过引入不同限制性酶切点的引物，实现目标基因的定向克隆，从而避免载体自身环化，提高克隆的效率。cDNA克隆利用PCR技术的关键步骤是逆转录，通过以少数mRNA为模板，使用oligo(dT)引物在依赖RNA的DNA聚合酶作用下，体外合成cDNA的第一链。接着，可以通过PCR扩增这一链。

在进一步优化中，如果在cDNA链的3'端加上鸟苷酸残基同聚物，可以使用oligo(dT)和oligo(dC)作为PCR扩增的引物，并可能在引物的5'端添加限制性酶切点，便于将双链DNA克隆到合适的载体中。特别是当已知RNA（或其基因）两端的序列，或者mRNA的5'端序列或其编码蛋白质N端的氨基酸序列时，可以设计出特异性的两端引物，直接克隆特定的目的基因cDNA，从而省去从cDNA文库中筛选克隆的繁琐步骤。

以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。