从生物体克隆目的基因的方法有哪些？

基因文库技术分离目的基因 所谓文库(1ibrary)是指一种全体的集合。基因文库(gene library)则是指某一生物类型全部基因的集合。这种集合是以重组体形式出现。某生物DNA片段群体与载体分子重组，重组后转化宿主细胞，转化细胞在选择培养基上生长出的单个菌落(或噬菌斑)(或成活细胞)即为一个DNA片段的克隆。全部DNA片段克隆的集合体即为该生物的基因文库。 构建基因文库的意义不只是使生物的遗传信息以稳定的重组体形式贮存起来，更重要的是它是分离克隆目的基因的主要途径。对于复杂的染色体DNA分子来说，单个基因所占比例十分微小，要想从庞大的基因组中将其分离出来，一般需要先进行扩增，所以需要构建基因文库。在很多情况下目的基因的分离都离不开基因文库。此外基因文库也是复杂基因组作图的重要依据。基因文库构建包括以下基本程序： ① DNA提取及片段化，或是cDNA的合成。 ② 载体的选择及制备。 ③ DNA片段或cDNA与载体连接。 ④ 重组体转化宿主细胞。 ⑤ 转化细胞的筛选。当获得了含重组体的宿主细胞时，即完成了基因的克隆。基因的克隆只是分离基因的基础，基因克隆后还要对克隆的基因进行分离，即利用各种手段把目的基因从文库中分离出来。分离出目的基因还必须对其进行必要的检测与分析：如进行序列测定，体外转录及翻译、功能互补实验等。通过这些实验确定出基因的结构及功能。到这时才能算分离到了目的基因。所以，基因的克隆、克隆基因的分离、分离基因的鉴定是利用基因文库技术分离目的基因的主要内容

1.PCR扩增克隆法

PCR扩增克隆法是在已知植物基因序列的基础上，进行基因序列克隆的一种方法。先从基因文库（genebank）中找到有关基因序列，据此合成一对寡聚核苷酸引物，从植物中提取染色体DNA或RNA，进行PCR扩增。扩增的片段纯化后插入合适的质粒载体上，用酶切分析和序列分析检测重组子，并与已知基因序列比较，以获得目的基因。

2.功能克隆法

功能克隆（functionalcloning）是根据性状的基本生化特征，在鉴定已知基因功能后进行克隆。该法在纯化相应的编码蛋白质后，构建cDNA文库或基因组文库。然后从文库中用下述两种方法进行基因筛选，其一是将纯化的蛋白质进行氨基酸测序，据此合成寡核苷酸探针，从cDNA文库或基因组文库中筛选编码基因；其二是将编码蛋白质制成相应抗体探针，从cDNA载体表达文库中筛选相应克隆。实行功能克隆的关键步骤是分离出高纯度蛋白质。对于产物不明的基因，不能利用这一方法进行克隆。

3.定位（图位）克隆法

定位（图位）克隆法（positionalcloning）根据目的基因在染色体上的位置，进而通过染色体步移（chromosomewalking）进行克隆。需预先建立具有目的基因的适宜遗传分离群体（近等基因系或分离群体），将目的基因精确定位在染色体特定的位置之后，用目的基因两侧紧密连锁的分子标记（RFLP标记）为探针，筛选基因组文库，得到阳性克隆，然后以阳性克隆的末端作为探针，获得含有目标基因的大片段克隆，然后以这些新的DNA为探针，获得更趋近目的基因的DNA片段，不断缩小筛选区域，逐步向目的基因靠近，最终克隆到该基因。

4.转座子标记法

转座子（transposon）是可从一个基因位置转移到另一位置的DNA片段，而原来位置的DNA片段（转座子）并未消失，发生转移的只是转座子的拷贝。基因转座可引起插入突变，使插入位置的基因失活，并诱导产生突变型。通过标记基因就可以检测出突变基因的位置，进而克隆该突变基因。这样将转座子作为基因定位的标记，并通过转座子在染色体上的插入和嵌合来克隆基因称为转座子标记法（transposontagging）。para>5.减法杂交法

该法根据植物表现型差异或基因在不同组织或器官的表达差异来克隆植物基因。特异性表达的基因，其mRNA表现不同。分别从表达特异性基因的植物组织和无特异性基因的组织中提取mRNA，反转录为cDNA，两者杂交。在两种组织中都表达的基因产物形成杂交分子，而特异mRNA转录的cDNA仍保持单链状态，将这种单链cDNA分离出来即为差异表达的基因，这一策略被称作减法杂。

6.mRNA差异显示法

该法可有效鉴别并克隆差异表达的基因。提取不同的mRNA后可用共同的引物反转录成cDNA，进行PCR扩增，获得差异表达的cDNA序列，作为探针，在cDNA文库或基因组文库中筛选基因，并作功能分析。该法可直观筛选差异表达的基因，比减法杂交操作方便、迅速，需要总RNA量少，效率高，短期内可完成cDNA的扩增、鉴定和克隆。