石蜡包埋对dna甲基化有影响吗
一种全新的DNA甲基化研究方法——Pyrosequencing技术
DNA甲基化是一种表观遗传修饰,它是由DNA甲基转移酶（DNA methyl-transferase,Dnmt）催化S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体,将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶（mC）的一种反应,在真核生物DNA中,5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基.CG二核苷酸是最主要的甲基化位点,它在基因组中呈不均匀分布,存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的区域,在哺乳动物中mC约占C总量的2－7％.一般说来,DNA的甲基化会抑制基因的表达.DNA的甲基化对维持染色体的结构、X染色体的失活、基因印记和肿瘤的发生发展都起重要的作用.
CpG双核苷酸在人类基因组中的分布很不均一,而在基因组的某些区段,CpG保持或高于正常概率,这些区段被称作CpG岛.CpG岛主要位于基因的启动子和第一外显子区域,约有60％以上基因的启动子含有CpG岛.CpG甲基化的研究在肿瘤的研究中有着非常主要的地位.通过基因启动子区及附近区域CpG岛胞嘧啶的甲基化可以在转录水平调节基因的表达,从而引起相应基因沉默,去甲基化又可恢复其表达.DNA甲基化在生理情况下就参与了控制基因的时空表达,在肿瘤发生时,肿瘤细胞全基因组低甲基化是一个重要特征.肿瘤细胞基因组甲基化的程度与正常细胞相比仅为20-60% ,同时伴有局部区域基因的高甲基化,包括肿瘤抑制基因、抑制肿瘤转移和浸润的基因、细胞周期调节基因、DNA修复基因、血管形成抑制基因等.但是目前研究手段的局限,限制了DNA甲基化的广泛研究.
近年来,研究者不断探索定性及定量检测单个或多个甲基化位点的方法,但由于甲基化多态性区域存在的密度很高,所以对于延伸反应其引物的位置很难设计.Pyrosequencing技术作为一种新的序列分析技术,能够快速地检测甲基化的频率,对样品中的甲基化位点进行定性及定量检测,为甲基化研究提供了新的途径.
从原理上来看,Pyrosequencing是一种通过合成方法进行序列分析的方法,它通过核苷酸和模板结合后释放的焦磷酸引发酶级联反应,促使荧光素发光并进行检测.这项技术曾经被用作单核苷酸多态性（SNP）的基因型和单倍型的检测,以及细菌和病毒的鉴定和分型研究.这项技术的一个主要特点是在Pyrogarm8482;软件上显示的峰值高度来自于序列分析的原始数据,通过峰值的高度可以精确的检测混合DNA模板中等位基因的频率.
目前甲基化研究方面,很多甲基化定量分析的报道采用亚硫酸氢盐处理甲基化样本,并用混合的PCR产物
作为校正.其主要原理是：亚硫酸氢盐可以将没有甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶,而在适当的实验条件下甲基化的胞嘧啶保持不变.因而,用它处理样本后,再进行PCR扩增,甲基化的位点可以被当作一个C/T的SNP来处理,它的基因频率为0－100％.在此,我们给大家介绍一个研究人员使用Pyrosequencing技术分析并精确定量DNA甲基化水平的例子.
研究者在一个Pyrosequencing反应中同时检测了6个甲基化位点.这种方法同样可以用于石蜡包埋的组织,并且具有较高的重复性和精确性.实验选择谷胱甘肽-S-转移酶π（GSTP1）转录启动位点的CpG岛进行检测.这些位点在正常前列腺组织中是非甲基化的,而在肿瘤样本中高甲基化.通过PCR扩增一个包含17个甲基化多态位点140bp的片段,并用4个测序引物研究其中15个位点（Table 1）.使用在线的SNP测序引物设计软件（Pyrosequencing AB）设计测序引物,其中一些甲基化多态性位点用最可能的碱基所代替,以减少计算的数量.再通过人工检测测序引物可能存在的错配.此外,同时在PSQ 96MA DNA分析仪上运行空白对照,扣除由测序引物、生物素标记的引物或是模板引起的背景.
PCR引物设计完全与模板相匹配,不覆盖任何甲基化多态性区域.使用10ng亚硫酸氢盐转化的DNA样本或是10 fmol纯化的PCR产物,10 pmol 正向（5’-GTGATTTAGTATTGG-3’）和反向（5’-biotin-AACTCTAAACCCCATC-3’）引物扩增GSTP1转录启动位点的基因片段,扩增片段长度为144bp.反应体系为60 mM Tris-SO4,pH 8.9,18 mM (NH4)2SO4,1 mM MgSO4,200 μM dNTPs,以及3 U Platinum Taq DNA高保真聚合酶,终体积为50μL.PCR循环设置：首先在95℃下变性4分钟,然后在95℃ 30S,50℃ 45S以及72℃ 20S条件下重复50个循环,最后一步延伸步骤在72℃下4分钟,中止反应.PCR反应在Eppendorf的Mastercycler 96
哺乳动物基因组中,DNA甲基化是指CpG二核苷酸中的胞嘧啶第5位碳原
DNA甲基化：DNA化学修饰的一种形式
1.蜡块的选择，在DNA提取前检查组织切片。如果有自溶、退变或组织结构不清，大片出血等改变的蜡块不能用；若哟明显坏存在的蜡块，最好不用或将坏死部分切去后再用。
2.由于固定和包埋组织由于化学修饰作用，使得DNA与蛋白质不易分离。因此必须增加SDS和蛋白酶K的浓度和作用时间：SDS可增至1%~2%，蛋白酶K可分次加入，并注意不时震摇，使酶与组织充分接触。
3.根据组织细胞密度和细胞外间质的多少，DNA释放率是有差异的。对于含有较多间质的肺组织，我们在预实验中观察孵育时间最少要达到24h。
4.在DNA提取过程中，应尽可能轻柔操作，避免过多地移管。若必需移管时应选用大口吸管。尽可能避免人为的DNA剪切。
BIOG石蜡包埋组织DNA抽提试剂盒对福尔马林固定、石蜡包埋的组织样本中的DNA提取很有用。
从石蜡包埋组织中提取DNA的基本步骤，是在常规DNA提取方法的基础上改良和演变而业。Goelz等（1985）最先提出的石蜡包埋组织DNA提取技术，是用机械的方法破碎组织，切除多余的石蜡，进入含SDS和高浓度蛋白酶K（1mg/ml）的提取缓冲液加温孵育，然后进行苯酚和氯仿抽提。 所得DNA虽不完整，但可被限制性内切酶切割，因而适于点杂交，印迹杂交等多种分了生物学实验。
Dubeau等（1986）在上述方法上作了改进。 首先通过组织切片和二甲苯和脱蜡，保证了组织的完全破碎，使细胞与消化液充分接触，使DNA释放和蛋白去除更加完全；其次通过两步消化的方法，将不适于做分子杂交的降解的DNA小段去除，仅保留那些可螺旋化的完整的DNA分子，从而提DNA质量，适于做Sorthern印迹杂交分析。Moerkerk等（1990）对上述两种方法进行了比较，发现两种方法所提行DNA之点杂交结果一致，非螺旋化DNA亦不影响杂交分析。
Goelz氏DNA提取方法的主要步骤
1. 切除多余石错，暴露组织
2. 将组织切碎（最大径<0.5mm），称重；
3. 溶于TE9提取液(组织<50mg/5ml.50－500mg/10ml),高速混悬2－3min，于48℃放置24h（TE9提取液的制备；500mmol/L Tris；20mmol/L EDTA；10mmol/L NaCl；1% SDS；500µg/ml 蛋白酶K；pH8.0）
4. 再次混悬组织，加入蛋白酶K至终浓度1mg/ml，SDS至2%，孵育40h；
5. 用等体积酚－氯仿溶液抽提3次；
6. 2.5倍体积乙醇沉淀DNA
7. -70℃放置2－4h
8. 9 000xg离心1h
9. 沉淀物用70%乙醇洗1次
10. 干燥，TE（pH7.2）溶解。
答：石蜡包埋组织的DNA因受固定剂的类型、固定时间、固定温度及组织处理过程等多种因素影响而极易断裂，故操作步骤不宜过多。如何提高石蜡包埋组织DNA提取质量，我们的体会是：1.蜡块的选择，在DNA提取前检查组织切片。如果有自溶、退变或组织结构不清，大片出血等改变的蜡块不能用；若哟明显坏存在的蜡块，...
答：该文章对16个配对FFPE和冰冻组织肺腺癌样本的NGS测序结果进行了比较,揭示了福尔马林固定对NGS数据的影响。 与冰冻组织相比,FFPE样本具有:1、文库插入片段更小 2、覆盖变化更大 3、在CpG区域发生C->T转换的概率增加,表明了DNA甲基化和福尔马林固定之间的影响。但是,在两种不同类型样品之间,错误发生率、文库复杂性、...
答：一般说来，DNA的甲基化会抑制基因的表达。DNA的甲基化对维持染色体的结构、X染色体的失活、基因印记和肿瘤的发生发展都起重要的作用。CpG双核苷酸在人类基因组中的分布很不均一，而在基因组的某些区段，CpG保持或高于正常概率，这些区段被称作CpG岛。CpG岛主要位于基因的启动子和第一外显子区域，约有6...
答：这福尔马林介导的甲基化直接影响DNA提取的效率。如果事实果真如此，那么固定时是一个重要的变异因素。然而，Goelz等，没有发现固定时间对DNA提取量的明显影响。Dubeau等认为组织固定时间太短或太长均会导致DNA的降解。该作者对固定12h到5天不同时间间隔标本的DNA提取显示，随着固定时间的延长，可螺旋化（Sp...
答：2、DNA样本：体积≥20ul，浓度≥100ng/ul，DNA总量≥2ug，20℃保存，低温冰袋运输。3、血液样本：要求保存于抗凝管中或冻存管中，体积大于2ml，请用干冰运送，保证DNA不降解。4、样品为石蜡包埋组织切片的，要求提供10张组织切片光片（面积>10mm×10mm,厚度约5-10um）。
答：准确且无放射性污染。该法的优点是：方法相对简单，不需预先知道CpG 位点及样本序列；可进行甲基化水平的定量研究；需要样本量少，可用于石蜡包埋样本的分析。缺点是：只能获得特殊酶切位点甲基化情况，因此检测阴性不能排除样品DNA中甲基化存在的可能；由于酶和PCR 的使用，序列分析受到限制。
答：DNA甲基化是表观遗传学的中最为常见的一种修饰，可以使细胞抑制病毒和非宿主DNA元素表达，促进对环境刺激的反应。异常的DNA甲基化对基因表达调控的影响与多种疾病相关。将甲基化信息和遗传信息相结合的多组学方法可以帮助破译复杂的通路和疾病机制。基于芯片的甲基化研究可以为基因表达调控提供有价值的信息，...
答：通常是设计两对引物,一对MSP引物扩增经亚硫酸氢盐处理后的DNA模板,另一对扩增未甲基化片段。若第一对引物能扩增出片段,则说明该检测位点存在甲基化,若第二对引物能扩增出片段,则说明该检测位点不存在甲基化。实验思路见参考文献[4]。 实验材料 新鲜、冷冻、石蜡包埋细胞或组织等 甲基化检测的其他技术还包括:...
答：Copy Number：SNP芯片得到的肿瘤组织比对正常组织的染色体上各片段的比值 Mutation：肿瘤组织测序结果相对参考基因组的核苷酸突变，包括插入和缺失等变化 Protein：蛋白芯片测序得到的约200种常见癌症相关蛋白的表达量 Methylation：甲基化芯片测得的DNA甲基化数据 Project：所有TCGA样本名均以这个开头 TSS: Tissue...
答：在此，我们给大家介绍一个研究人员使用Pyrosequencing技术分析并精确定量DNA甲基化水平的例子。研究者在一个Pyrosequencing反应中同时检测了6个甲基化位点。这种方法同样可以用于石蜡包埋的组织，并且具有较高的重复性和精确性。实验选择谷胱甘肽-S-转移酶π（GSTP1）转录启动位点的CpG岛进行检测。这些位点在正常...
