PCR产物的酶切问题
kuaidi.ping-jia.net 作者：佚名 更新日期：2024-07-23
PCR产物酶切遇到的问题
有这样的情况，一种是你选择酶的时候选择错误，在你该段基因上根本不存在这个酶切位点。
二是你根据别人发表序列确定了存在该酶切位点，但是因为基因突变等情况，导致你的病例酶切位点发生变化。
三是即使你病例存在了酶切位点，因为酶切体系的不合适，比如底物浓度过高，酶失活等，使得酶切失败。
肯定是没有切点
应该先弄清楚序列看看到底有没有切点
如果序列比较少，有没有切点，用眼瞅一下就可以了
如果序列比较多，可以用酶切位点分析工具
http://www.yelinsky.com/blog/archives/278.html
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你做了酶切的阳性对照没有，说不定你的酶切体系不对或者酶过期了。如果还不行，建议你回收PCR产物测序，看酶切位点是否突变了。
PCR产物的酶切问题
答：结果不确定，第一种可能性是：你PCR反应的温度（退火温度）和时间（延伸时间）没有掌握好。因为PCR反应的特异性决定于退火温度的高低，退火温度越低，应物越容易发生错配，这样的话也会有杂带。第二种可能是酶切不完全，也就是你酶切时间不够，不过你说酶切过夜了，这种可能性不会很大。还有一种可...
PCR产物的酶切问题
答：PCR-RFLP技术我曾经做过，说实话这并不是一个稳定有效的鉴定方法，当时我也遇到和你一样的问题。有这样的情况，一种是你选择酶的时候选择错误，在你该段基因上根本不存在这个酶切位点。二是你根据别人发表序列确定了存在该酶切位点，但是因为基因突变等情况，导致你的病例酶切位点发生变化。三是即使...
如何对PCR扩增的产物进行酶切?
答：Fermentas公司的研究表明，限制性内切酶在 PCR扩增体系中仍然有部分活性，可以通过稀释（3倍以上）扩增混合液，适当提高酶量和反映时间，进行酶切。个人认为需要对PCR产物进行酶切分析通常是为了或基因表 型分析，由于Taq，Pfu等高温聚合酶在酶切温度（37度或更高）下，仍然保持一定的活性，高温聚合酶所...
如何对PCR扩增的产物进行酶切?
答：1. 首先确认PCR产物，取一小部分PCR产物跑胶。2. 如果产物良好，一个特异性很强的条带，则用过柱的方法提纯（就是你平时用的从溶液中纯化DNA的试剂盒就可以）。楼上说的跑胶后再提，早就过时了。效率很低。3，提纯加入限制性内切酶缓冲液，酶。按照平时的方法反应就可以了。4. 酶切后再过柱提...
PCR产物酶切的问题
答：MspI酶，或者说任何DNA限制酶都有一个最适合的底物浓度去反应，我估计你的PCR产物浓度很大，你不妨考虑一下这一点。至于你说的酶切产物变大的这个问题，个人认为你用1%的胶去跑290bp的条带是测不准的。其二，3%跑出来显示310bp也不一定是这个大小，极有可能是你根本就没有切开。你不妨把你酶切的...
pcr产物没有纯化能够直接进行双酶切吗?
答：不可以。\x0d\x0a首先，采用的是质粒模板；\x0d\x0a其次，扩增得到的非单一条带，如果不纯化直接酶切，那么得到的将是带有相应酶切位点的几种片段，继续试验的话，菌落PCR鉴定时可能会出现几种不同大小的条带。\x0d\x0a\x0d\x0a第三、PCR产物里面缓冲液并不是合适的酶切缓冲液，会极大...
PCR产物的酶切问题
答：PCR-RFLP技术我曾经做过，说实话这并不是一个稳定有效的鉴定方法，当时我也遇到和你一样的问题。有这样的情况，一种是你选择酶的时候选择错误，在你该段基因上根本不存在这个酶切位点。二是你根据别人发表序列确定了存在该酶切位点，但是因为基因突变等情况，导致你的病例酶切位点发生变化。三是即使...
pcr产物酶切
答：先分析PCR产物序列上有几个你用的内切酶的酶切位点，然后每两个酶切位点之间的长度就是各个片段之间的长度，由于内切酶的酶切效率，酶切位点不一定会被酶切断，所以要考虑的是‘每两个’酶切位点之间的长度，而不仅仅是‘相邻两个’酶切位点之间的长度。
PCR过程,引物,酶切位点的问题
答：如果PCR产物需要酶切，就需要加上保护碱基。不同酶切位点所需要的保护碱基是不一样的，一般参考NEB网站上的一个保护碱基表。一搜就有了。如果不做PCR产物酶切而是直接连接T载体，就可以不加保护碱基，PCR结束后直接加A连T,然后按流程操作就可以了。一般是需要转化-验证-测序，如果是构建表达载体的话...
酶切技术的技术问题
答：1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。双酶切时间...
能说一下你这样酶切的目的么？40bp和36bp的条带，只相差4个bp，基本上在琼脂糖胶上就不用考虑分清楚了。最好使用聚丙烯酰胺凝胶，很多用变性聚丙烯酰胺凝胶，可以分离到碱基数相差很少的条带，而某些变性梯度聚丙烯酰胺胶，甚至能分辨只相差一个碱基的核酸。
所以如果你一定要分清40和36bp的带，就用聚丙烯酰胺试试。
MspI酶，或者说任何DNA限制酶都有一个最适合的底物浓度去反应，我估计你的PCR产物浓度很大，你不妨考虑一下这一点。
至于你说的酶切产物变大的这个问题，个人认为你用1%的胶去跑290bp的条带是测不准的。其二，3%跑出来显示310bp也不一定是这个大小，极有可能是你根本就没有切开。你不妨把你酶切的东西回收起来测序去看看到底是什么东西，看看到底切开了没有。
有这样的情况，一种是你选择酶的时候选择错误，在你该段基因上根本不存在这个酶切位点。
二是你根据别人发表序列确定了存在该酶切位点，但是因为基因突变等情况，导致你的病例酶切位点发生变化。
三是即使你病例存在了酶切位点，因为酶切体系的不合适，比如底物浓度过高，酶失活等，使得酶切失败。
肯定是没有切点
应该先弄清楚序列看看到底有没有切点
如果序列比较少，有没有切点，用眼瞅一下就可以了
如果序列比较多，可以用酶切位点分析工具
http://www.yelinsky.com/blog/archives/278.html
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你做了酶切的阳性对照没有，说不定你的酶切体系不对或者酶过期了。如果还不行，建议你回收PCR产物测序，看酶切位点是否突变了。
答：结果不确定，第一种可能性是：你PCR反应的温度（退火温度）和时间（延伸时间）没有掌握好。因为PCR反应的特异性决定于退火温度的高低，退火温度越低，应物越容易发生错配，这样的话也会有杂带。第二种可能是酶切不完全，也就是你酶切时间不够，不过你说酶切过夜了，这种可能性不会很大。还有一种可...
答：PCR-RFLP技术我曾经做过，说实话这并不是一个稳定有效的鉴定方法，当时我也遇到和你一样的问题。有这样的情况，一种是你选择酶的时候选择错误，在你该段基因上根本不存在这个酶切位点。二是你根据别人发表序列确定了存在该酶切位点，但是因为基因突变等情况，导致你的病例酶切位点发生变化。三是即使...
答：Fermentas公司的研究表明，限制性内切酶在 PCR扩增体系中仍然有部分活性，可以通过稀释（3倍以上）扩增混合液，适当提高酶量和反映时间，进行酶切。个人认为需要对PCR产物进行酶切分析通常是为了或基因表 型分析，由于Taq，Pfu等高温聚合酶在酶切温度（37度或更高）下，仍然保持一定的活性，高温聚合酶所...
答：1. 首先确认PCR产物，取一小部分PCR产物跑胶。2. 如果产物良好，一个特异性很强的条带，则用过柱的方法提纯（就是你平时用的从溶液中纯化DNA的试剂盒就可以）。楼上说的跑胶后再提，早就过时了。效率很低。3，提纯加入限制性内切酶缓冲液，酶。按照平时的方法反应就可以了。4. 酶切后再过柱提...
答：MspI酶，或者说任何DNA限制酶都有一个最适合的底物浓度去反应，我估计你的PCR产物浓度很大，你不妨考虑一下这一点。至于你说的酶切产物变大的这个问题，个人认为你用1%的胶去跑290bp的条带是测不准的。其二，3%跑出来显示310bp也不一定是这个大小，极有可能是你根本就没有切开。你不妨把你酶切的...
答：不可以。\x0d\x0a首先，采用的是质粒模板；\x0d\x0a其次，扩增得到的非单一条带，如果不纯化直接酶切，那么得到的将是带有相应酶切位点的几种片段，继续试验的话，菌落PCR鉴定时可能会出现几种不同大小的条带。\x0d\x0a\x0d\x0a第三、PCR产物里面缓冲液并不是合适的酶切缓冲液，会极大...
答：PCR-RFLP技术我曾经做过，说实话这并不是一个稳定有效的鉴定方法，当时我也遇到和你一样的问题。有这样的情况，一种是你选择酶的时候选择错误，在你该段基因上根本不存在这个酶切位点。二是你根据别人发表序列确定了存在该酶切位点，但是因为基因突变等情况，导致你的病例酶切位点发生变化。三是即使...
答：先分析PCR产物序列上有几个你用的内切酶的酶切位点，然后每两个酶切位点之间的长度就是各个片段之间的长度，由于内切酶的酶切效率，酶切位点不一定会被酶切断，所以要考虑的是‘每两个’酶切位点之间的长度，而不仅仅是‘相邻两个’酶切位点之间的长度。
答：如果PCR产物需要酶切，就需要加上保护碱基。不同酶切位点所需要的保护碱基是不一样的，一般参考NEB网站上的一个保护碱基表。一搜就有了。如果不做PCR产物酶切而是直接连接T载体，就可以不加保护碱基，PCR结束后直接加A连T,然后按流程操作就可以了。一般是需要转化-验证-测序，如果是构建表达载体的话...
答：1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。双酶切时间...
