在PCR扩增实验中应注意什么？
kuaidi.ping-jia.net 作者：佚名 更新日期：2024-06-30
我想问做PCR扩增应该注意的事项？
2. Taq DNA聚合酶具有5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，但无3’-5’外切酶活性，因此对单核苷酸的错配无校正功能，发生碱基错配的几率为 2.1×10-4左右。然而Taq DNA聚合酶的优势在于反应产量高于其他DNA聚合酶。Stratagene推出的Pfu DNA聚合酶一直是研究人员心目中最好的高保真酶，而Pfu DNA聚合酶经基因工程改造后，新创出的Pfu Ultra具有更佳的校验活力。数据显示Pfu UltraTM高保真DNA聚合酶的平均错配率为Pfu DNA聚合酶的1/3，为Taq DNA聚合酶的1/18，是目前保真度最高的PCR酶(保真度＝1/错误率) (数据来源：美国冷泉港实验室)。
3. Mg2+浓度也是影响反应效率和特异性的重要因素之一。Taq DNA聚合酶对Mg2+浓度非常敏感，Mg2+可与模板DNA、引物及dNTP等的磷酸根结合，不同反应体系中应适当调整MgCl2的浓度，一般以比 dNTP总浓度高出0.5～1.0mmol/L为宜，Mg2+过量能增加非特异扩增。
4. dNTP的浓度过高会增加碱基的错误掺入率，使反应特异性下降；过低则会导致反应速度下降。使用时4种dNTP必须以等当量浓度配制，均衡的dNTP有利于减少错配误差和提高使用效率。
5. 温度循环参数中应特别注意复性温度，它决定引物与模板的特异性结合。退火复性温度可根据引物的长度，通过Tm＝4(G+C)+2(A+T) 计算得到。在Tm允许的范围内，选择较高的退火温度可大大减少引物与模板之间的非特异结合。
6. 减低污染的常规措施：①将PCR试剂、PCR产物及其他分子生物学试剂分开放置；②应保持样品制备、PCR反应液配制与PCR产物分析三个工作区的独立性；③使用阳性和阴性对照；④使用最高质量的水配制PCR实验的所有反应试剂；⑤配制好的PCR反应试剂应分成小包装储存，每个包装仅用于单次实验；⑥制备样品、配制试剂及反应液时必须戴手套；⑦实验前一定要认真清洁加样器等。
以前反应产生的气溶胶会成为副反应模板，必须出去，通常使用识别dUTP的内切酶除去外来的模板
注意模板的纯度，通常DNA，RNA，甚至单个细胞都是可以作为模板的，但DNA的纯度可以达到很好，而RNA次之，细胞的非特异性很多，建议使用DNA模板
酶需要用高保真和高速率的，推荐taq系列的，1kbp左右的速率，实验室常用
引物的设计，通常在20~30bp之间，退火温度50℃~60℃，设计时保证引物的特异结合，减少非特异结合
所需的原料，酶等等，还有温度
PCR实验操作注意事项有哪些
答：1、必须在无菌无尘环境下进行操作；2、检测人员必须通过国家临检中心业务培训并取得合格证书；3、必须拥有标准的的PCR荧光实验室；4、后PCR区PCR完成以后，应该留出一个专门用于反应后处理样品的地方。
石斛pcr注意事项
答：石斛pcr注意事项：实验室安全、设计引物、RNA/DNA提取、扩增条件的优化、正负对照、防止污染、数据分析。1、实验室安全：确保在实验室中遵循适当的安全措施，包括佩戴实验室服装、手套和安全眼镜，遵守实验室规章制度，正确处置废弃物等。2、设计引物：选择合适的引物用于PCR扩增过程。针对石斛基因的引物应该...
荧光定PCR中的注意事项
答：因为RNA一旦降解所定量的结果就不能正确反映样品中mRNA的量，所得的结果也是错误的。所以在RNA提取过程中要严格遵守操作规范，避免RNA酶的污染。2. RNA样品中的基因组DNA污染 提取的RNA样品中不可避免地混有少量的基因组DNA。基因组DNA对试验有两个影响：一是影响对RNA的精确定量；二是影响PCR扩增的...
PCR实验过程中的注意事项
答：实验操作注意事项 尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因,样品间的交叉污染也是原因之一.因此,不仅要在进行扩增反应是谨慎认真,在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意：1. 戴一次性手套,若不小心溅上反应液,立即更换手套；2. 使用一次性吸头,严禁与PCR产物分析室的吸头混用,吸头不要...
在基因进行pcr扩增过程中涉及到哪些要素?其中哪些因素决定了其效率...
答：3，合适的反应体系，就是聚合酶、模板、引物、buffer、dNTP、水、Mg2+离子等的配比合适，体系总量合适。4，退火温度，影响着产物纯度，也就是影响反应的特异性及反应效率。5，配制反应体系还有上样时注意不要互相污染，直接影响扩增结果。6，配制体系时最好先加入ddH2O，最好最后加入酶或模板，防止提前...
“RT-PCR扩增目的基因cDNA”需要注意的事项有哪些?
答：常用的反转录酶有两种，即鸟类成髓细胞性白细胞 病毒反转录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒反转录酶。 RNA 的反转录过程遇到的问题 1． 在实验过程中要防止 RNA 的降解，保持 RNA 的完整性。在总 RNA 的提取 过程中，注意避免 mRNA 的断裂。 2． 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对 照。 3． 内参的...
反转录PCR注意事项
答：在实验设计中，内参的选择不容忽视。常用的选择如G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）和β-Actin（β-肌动蛋白），它们的作用在于校正RNA的定量误差，以及减小加样和反应体系不一致等因素带来的影响。PCR扩增过程中的平台效应是个关键问题，它受目的基因长度、序列、二级结构及初始DNA量等因素影响。针对每个...
进行分子实验时,如酶切反应、PCR扩增等,加入酶时应注意哪些问题?
答：冰上操作，充分混匀，控制用量，控制反应时间 冰上操作:使用过程中注意对酶的保护，以免失活 充分混匀:充分混匀才能使酶充分发挥作用 控制用量:过多的酶会导致星活性(比如用限制性内切酶的酶切实验)，即酶切错误;PCR中酶加得过多也容易导致非特异扩增 控制反应时间:根据具体的酶、具体的实验确定相应...
进行分子实验时,如酶切反应、PCR扩增等,加入酶时应注意哪些问题?
答：冰上操作，充分混匀，控制用量，控制反应时间 冰上操作：使用过程中注意对酶的保护，以免失活 充分混匀：充分混匀才能使酶充分发挥作用 控制用量：过多的酶会导致星活性（比如用限制性内切酶的酶切实验），即酶切错误；PCR中酶加得过多也容易导致非特异扩增 控制反应时间：根据具体的酶、具体的实验确定...
PCR实验最常见的9个问题及解决方案
答：1. 如何有效设计引物 （1）使用Oligo或Primer设计引物，在保守区内设计，长度一般在18-27bp，上下游引物Tm值最好是60-75℃，GC含量=40%-60%，引物自身及引物之间不应存在互补序列，避免发夹结构。2. PCR 电泳无扩增条带 （1）酶失活或在反应体系中未加入酶。TaqDNA聚合酶因保存或运输不当而...
PCR扩增：是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法
实验操作注意事项：尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意：
(1)戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套。
(2)使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染。
(3)避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面。
(4)操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度。
(5)最后加入反应模板，加入后盖紧反应管。
(6)操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性。
(7)尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器，至少PCR操作过程中加样器应该专用，不能交叉使用，尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区。
(8)重复实验，验证结果，慎下结论。（搬运过来的）
2. Taq DNA聚合酶具有5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，但无3’-5’外切酶活性，因此对单核苷酸的错配无校正功能，发生碱基错配的几率为 2.1×10-4左右。然而Taq DNA聚合酶的优势在于反应产量高于其他DNA聚合酶。Stratagene推出的Pfu DNA聚合酶一直是研究人员心目中最好的高保真酶，而Pfu DNA聚合酶经基因工程改造后，新创出的Pfu Ultra具有更佳的校验活力。数据显示Pfu UltraTM高保真DNA聚合酶的平均错配率为Pfu DNA聚合酶的1/3，为Taq DNA聚合酶的1/18，是目前保真度最高的PCR酶(保真度＝1/错误率) (数据来源：美国冷泉港实验室)。
3. Mg2+浓度也是影响反应效率和特异性的重要因素之一。Taq DNA聚合酶对Mg2+浓度非常敏感，Mg2+可与模板DNA、引物及dNTP等的磷酸根结合，不同反应体系中应适当调整MgCl2的浓度，一般以比 dNTP总浓度高出0.5～1.0mmol/L为宜，Mg2+过量能增加非特异扩增。
4. dNTP的浓度过高会增加碱基的错误掺入率，使反应特异性下降；过低则会导致反应速度下降。使用时4种dNTP必须以等当量浓度配制，均衡的dNTP有利于减少错配误差和提高使用效率。
5. 温度循环参数中应特别注意复性温度，它决定引物与模板的特异性结合。退火复性温度可根据引物的长度，通过Tm＝4(G+C)+2(A+T) 计算得到。在Tm允许的范围内，选择较高的退火温度可大大减少引物与模板之间的非特异结合。
6. 减低污染的常规措施：①将PCR试剂、PCR产物及其他分子生物学试剂分开放置；②应保持样品制备、PCR反应液配制与PCR产物分析三个工作区的独立性；③使用阳性和阴性对照；④使用最高质量的水配制PCR实验的所有反应试剂；⑤配制好的PCR反应试剂应分成小包装储存，每个包装仅用于单次实验；⑥制备样品、配制试剂及反应液时必须戴手套；⑦实验前一定要认真清洁加样器等。
以前反应产生的气溶胶会成为副反应模板，必须出去，通常使用识别dUTP的内切酶除去外来的模板
注意模板的纯度，通常DNA，RNA，甚至单个细胞都是可以作为模板的，但DNA的纯度可以达到很好，而RNA次之，细胞的非特异性很多，建议使用DNA模板
酶需要用高保真和高速率的，推荐taq系列的，1kbp左右的速率，实验室常用
引物的设计，通常在20~30bp之间，退火温度50℃~60℃，设计时保证引物的特异结合，减少非特异结合
所需的原料，酶等等，还有温度
PCR扩增：是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法
答：1、必须在无菌无尘环境下进行操作；2、检测人员必须通过国家临检中心业务培训并取得合格证书；3、必须拥有标准的的PCR荧光实验室；4、后PCR区PCR完成以后，应该留出一个专门用于反应后处理样品的地方。
答：石斛pcr注意事项：实验室安全、设计引物、RNA/DNA提取、扩增条件的优化、正负对照、防止污染、数据分析。1、实验室安全：确保在实验室中遵循适当的安全措施，包括佩戴实验室服装、手套和安全眼镜，遵守实验室规章制度，正确处置废弃物等。2、设计引物：选择合适的引物用于PCR扩增过程。针对石斛基因的引物应该...
答：因为RNA一旦降解所定量的结果就不能正确反映样品中mRNA的量，所得的结果也是错误的。所以在RNA提取过程中要严格遵守操作规范，避免RNA酶的污染。2. RNA样品中的基因组DNA污染 提取的RNA样品中不可避免地混有少量的基因组DNA。基因组DNA对试验有两个影响：一是影响对RNA的精确定量；二是影响PCR扩增的...
答：实验操作注意事项 尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因,样品间的交叉污染也是原因之一.因此,不仅要在进行扩增反应是谨慎认真,在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意：1. 戴一次性手套,若不小心溅上反应液,立即更换手套；2. 使用一次性吸头,严禁与PCR产物分析室的吸头混用,吸头不要...
答：3，合适的反应体系，就是聚合酶、模板、引物、buffer、dNTP、水、Mg2+离子等的配比合适，体系总量合适。4，退火温度，影响着产物纯度，也就是影响反应的特异性及反应效率。5，配制反应体系还有上样时注意不要互相污染，直接影响扩增结果。6，配制体系时最好先加入ddH2O，最好最后加入酶或模板，防止提前...
答：常用的反转录酶有两种，即鸟类成髓细胞性白细胞 病毒反转录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒反转录酶。 RNA 的反转录过程遇到的问题 1． 在实验过程中要防止 RNA 的降解，保持 RNA 的完整性。在总 RNA 的提取 过程中，注意避免 mRNA 的断裂。 2． 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对 照。 3． 内参的...
答：在实验设计中，内参的选择不容忽视。常用的选择如G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）和β-Actin（β-肌动蛋白），它们的作用在于校正RNA的定量误差，以及减小加样和反应体系不一致等因素带来的影响。PCR扩增过程中的平台效应是个关键问题，它受目的基因长度、序列、二级结构及初始DNA量等因素影响。针对每个...
答：冰上操作，充分混匀，控制用量，控制反应时间 冰上操作:使用过程中注意对酶的保护，以免失活 充分混匀:充分混匀才能使酶充分发挥作用 控制用量:过多的酶会导致星活性(比如用限制性内切酶的酶切实验)，即酶切错误;PCR中酶加得过多也容易导致非特异扩增 控制反应时间:根据具体的酶、具体的实验确定相应...
答：冰上操作，充分混匀，控制用量，控制反应时间 冰上操作：使用过程中注意对酶的保护，以免失活 充分混匀：充分混匀才能使酶充分发挥作用 控制用量：过多的酶会导致星活性（比如用限制性内切酶的酶切实验），即酶切错误；PCR中酶加得过多也容易导致非特异扩增 控制反应时间：根据具体的酶、具体的实验确定...
答：1. 如何有效设计引物 （1）使用Oligo或Primer设计引物，在保守区内设计，长度一般在18-27bp，上下游引物Tm值最好是60-75℃，GC含量=40%-60%，引物自身及引物之间不应存在互补序列，避免发夹结构。2. PCR 电泳无扩增条带 （1）酶失活或在反应体系中未加入酶。TaqDNA聚合酶因保存或运输不当而...
