简述细菌检测的方法及优缺点
涂片镜检将病料涂于清洁无油污的载玻片上，干燥后在酒精灯火焰上固定，选用单染色法（如美蓝染色法）、革兰染色法、抗酸染色法或其他特殊染色法染色镜检，根据所观察到的细菌形态特征，作出初步诊断或确定进一步检验的步骤。分离培养根据所怀疑传染病病原菌的特点，将病料接种于适宜的细菌培养基上，在一定温度（常为37°C)下进行培养，获得纯培养苗后，再用特殊的培养基培养，进行细菌的形态学、培养特征、生化特性、致病力和抗原特性鉴定。动物实验用灭菌生理盐水将病料做成1:10悬液，或利用分离培养获得的细菌液感染实验动物，如小白鼠、大白鼠、豚鼠、家兔等。感染方法可用皮下注射、肌内注射、腹腔注射、静脉注射或脑内注射。感染后按常规隔离伺养管理，注意观察，有时还须对某种实验动物测量体温；如有死亡，应立即进行剖检及细菌学检查。
10种常用的细菌检测方法
一、[3H]脱氧胸苷摄入法测定细胞数：
1、用RPMI-1640培养液洗涤对数生长期（培养3天）的CTLL-2细胞两次，每次250×g离心10分钟，洗去培养液中残存的IL-2。
2、用台盼蓝（1% Trypan blue）染色法计数细胞并决定细胞的活力，用10%小牛血清的RPMI-1640培养液悬浮细胞至1×105/ml。
3、在96孔细胞培养板中每孔加0.1ml倍比稀释的标准IL-2或待测样品，每个稀释度三个复孔，标准IL-2从40 IU/ml稀释到0.019 IU/ml（8～10个稀释度），阴性对照孔不加IL-2。
4、每孔加0.1ml细胞悬液，在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养18～24小时。每孔加10μl（0.5μCi或1.85×104Bq）[3H]脱氧胸苷，继续培养4小时。
5、用多头细胞收集器将细胞收集到玻璃纤维滤纸上，用3%醋酸水溶液滤纸3次，洗去游离的[3H]TdR。将滤纸置液体闪烁瓶中，加入5ml闪烁液。在液体闪烁仪上计数细胞摄入的同位素活性（每分钟放射性计数，cpm），根据仪器效率换算成dpm（每分钟衰变数）。
6、用dpm值对样品稀释倍数作图。在图上，标准IL-2的曲线与待测样品的曲线应当呈平行的S型，说明是同样的分子反应。比较同样dpm处的不同稀释倍数，决定待测样品的相应浓度。
二、MTT检测法：
1、取96孔细胞培养板，每孔中加0.1ml含2×104～10×104靶细胞的培养液（含10%小牛血清的RPMI-1640培养液），在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养2～3小时让细胞帖壁（如果是悬浮细胞可直接进行下一步）
2、用RPMI-1640培养液2～10倍递次稀释细胞因子标准品，根据情况2～5倍递次稀释待检样品，每孔加0.1ml稀释的标准品和待检样品，每个稀释度3个重复孔。对照孔6个：3个阳性对照孔，每孔加0.1ml含大剂量细胞因子的RPMI-1640培养液，3个阴性对照孔，每孔加0.1ml RPMI-1640培养液。在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养24～48小时或预定的时间。
3、吸去培养液，用PBS洗涤一次（如为悬浮细胞，应在吸去上清液前离心培养板）。
4、每孔加0.1ml PBS和10μl MTT染液，在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养4～6小时。
5、每孔加0.1ml酸化异丙醇，也可用含10% SDS的10mmol/L HCl代替酸化异丙醇，在振荡器上振荡混匀，让还原产物充分溶解。置酶联检测仪上测定光密度（OD）值，检测波长570nm，参考波长630nm。以OD值对样品稀释度作图，比较标准曲线和待测样品曲线即可求得待测样品中细胞因子的含量。
三、XTT检测法：
用XTT代替MTT可省去溶解还原产物结晶的步骤，XTT可以被活细胞中的代谢酶还原成黄色水溶性的代谢产物（formazan）。代谢产物在OD450处有吸收峰。
四、MTS检测法：
1、培养IL-2依赖细胞株CTLL-2细胞或HT-2细胞（检测IL-2），或者IL-3依赖细胞株FDC-P1细胞或FL5.12细胞（检测IL-3）到对数生长期。
2、取96孔细胞培养板，每孔加0.1ml含1×104～2×104上述细胞之一的DMEM培养液（加10%小牛血清）。
3、每孔加0.1ml系列稀释的待测细胞因子（IL-2或IL-3）样品或细胞因子标准品，在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养24小时。
4、每孔加20μl MTS/PMS混合液，继续培养3～4小时显色。
5、检测前摇晃培养板10秒钟，混匀颜色。在酶联检测仪上，波长570nm（或490nm，或570nm和690nm）处检测各孔的光吸收值（OD）。用样品稀释度对OD值（OD570、OD490或OD570/OD690）绘制剂量-反应曲线，根据标准品曲线计算样品中细胞因子的量。
五、NAG检测法：
1、按MTT检测法培养细胞和用不同稀释度的细胞因子处理细胞。
2、吸去培养液，用PBS洗涤两次（如为悬浮细胞，应在吸去上清液前先离心）。
3、每孔加60μl NAG染液，在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养4小时。
4、每孔加90μl终止液，混匀后置酶联检测仪上测定光密度（OD）值，检测波长402nm。以OD值对样品稀释度作图，比较标准曲线和待测样品曲线即可求得待测样品中细胞因子的含量。
六、AlamarBlueTM摄入法：
1、按MTT检测法培养细胞和用不同稀释度的细胞因子处理细胞。
2、在培养结束前24小时加入Alamar Blue染料，96孔细胞培养板每孔20μl。
3、在培养结束后，直接在酶联检测仪上测定光吸收值。氧化型Alamar Blue的最大光吸收在570nm，用OD570减去OD600即为活细胞还原的Alamar Blue染料，颜色深浅与活细胞数成正比。
七、碱性磷酸酶检测法（AKP法）：
1、按MTT法用细胞因子处理靶细胞适当时间，用PBS洗去死亡细胞，洗两次。
2、向96孔细胞培养板各孔中加0.2ml新鲜配制的底物液（0.2mol/L 硼酸，1mmol/L MgCl2，1.2mmol/L甲伞基磷酸）。在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养3小时。
3、在荧光计数仪上测定荧光的量。根据测定已知不同数目细胞的荧光量作出标准曲线，根据标准曲线可得到各孔中的活细胞数。
八、三磷酸腺苷检测法（ATP法）：
1、ATP反应液（Bio-Orbit）是粉末状混合物，含有荧光素、荧光素酶、0.5mmol醋酸镁、50mg BSA和0.1μmol无机焦磷酸。在4℃可以保存1个月。用前用10ml含2mmol/L EDTA的0.1mol/L pH7.75 Tris-醋酸缓冲液稀释。稀释液分装后可在－20℃长期保存。
2、在已经完成促增殖或抑生长试验后的96孔细胞培养板中（每孔含100μL细胞培养液），每孔加0.1ml ATP释放因子，室温中反应5分钟。取另一块96孔细胞培养板，从第一块板的各孔中吸0.1ml细胞溶解物到第二块板的相应各孔。
3、在低于25℃中，将第二块板置自动多孔荧光检测仪中。用自动加样器，每孔加入20μl ATP反应液，立即检测10秒钟的荧光强度。温度升高，检测敏感性就下降。
4、用RLU（Y轴）对细胞因子标准品的稀释度（X轴）作标准曲线，根据标准曲线确定待测样品中细胞因子的含量。
九、染料染色法测定细胞数：
1）结晶紫检测法：
1、在96孔细胞培养板各孔中加0.1ml含5×104～10×4 WEHI-164细胞的培养液（含10%小牛血清的RPMI-1640培养液），37℃ 5% CO2的二氧化碳培养箱中培养2～3小时，让细胞帖壁。
2、用RPMI-1640培养液10倍递次稀释TNF标准品，根据需要3～5倍递次稀释待检样品，每孔加0.1ml稀释的标准品或待检样品，每个稀释度3个重复孔。对照孔6个，3个阳性对照孔各加0.1ml含4μg TNF的RPMI-1640培养液，3个阴性对照孔各加100μl RPMI-1640培养液。继续培养18～24小时。
3、甩去培养液，用PBS小心洗涤一次，每孔加0.1ml 10%甲醇溶液固定细胞30秒钟。
4、吸去甲醇溶液，每孔加0.1ml结晶紫染液，室温中放置20分钟。
5、轻轻甩去染色液，用蒸馏水洗涤各孔，将培养板倒置于吸水纸上吸干水分。自然干燥或37℃烘干。此板可以在室温中长期保存。
6、测定前，每孔加0.1ml 33%醋酸脱色，充分振荡后在570nm处测定光吸收度。用光吸收度（OD）值对样品稀释度作图，比较标准品曲线和待检样品曲线即可得到待测样品中的细胞因子活性
2）NBB检测法：
1、在用细胞因子处理靶细胞以后倾去培养液，倒置培养板于吸水纸上吸干培养液。再用100μl磷酸缓冲盐水小心洗去死细胞，用吸水纸吸干培养液。
2、每孔加100μl NBB染液，室温中染色30分钟。轻轻染液。用吸水纸吸干染液。
3、每孔加100μl福尔马林固定液固定15分钟。用自来水轻轻洗去固定液，倒置培养板，用吸水纸吸干染液。
4、每孔加150μl 50mmol/L氢氧化钠。轻轻振荡培养板直到染料全部溶解并均匀分布。在分光光度计上读取各孔在620nm处的光密度（OD）值。计算TNF的活性。
3）美蓝染色检测法：
1、用细胞因子处理靶细胞，在含100μL细胞培养液的检测孔中，每孔加0.02ml 25%戊二醛固定活细胞15分钟，用自来水缓缓洗去死细胞和固定液。
2、每孔加0.1ml 0.05%美蓝染液，染色20分钟，用自来水缓缓冲净染液，晾干。
3、每孔加0.2ml 0.33mol/L盐酸溶解美蓝，振荡混匀。在665nm波长处测定光吸收度。计算TNF的活性。
4）中性红染色检测法：
1、用细胞因子处理靶细胞，在含100μL细胞培养液的检测孔中，每孔加50μl 5%中性红染液。继续培养2小时。
2、小心倒去培养液。用200μl Hanks液洗涤细胞1次。小心倒去培养液，减少细胞丢失。
3、每孔加100μl脱色液，在摇床中轻轻摇晃溶解30分钟。在550nm波长处测定OD值。
十、直接计数细胞：
1、如果靶细胞是帖壁细胞，在细胞因子作用适当时间后，用生理盐水洗去死亡细胞，用0.25%胰蛋白酶液消化细胞。加适量生理盐水吹打，使细胞分散成单个细胞。直接在血细胞计数板上计数细胞。
2、如果靶细胞是悬浮细胞，则需要用染色剂区分死细胞和活细胞然后再计数。通常用台盼蓝染色细胞，活细胞可以排除进入细胞的台盼蓝而不着染，死细胞着染呈深蓝色。
3、计数血细胞计数板上4个大方格中的全部活细胞，按下式计算活细胞数：活细胞数（个/ml）＝计数的全部活细胞数×10 000×2×1/4。
可以直接用显微镜观察其运动情况。另外，鞭毛是细菌的运动器官，因此还可以通过检测细菌鞭毛的存在来间接判断细菌是否具有动力。记忆中的方法有这些：
1.使用显微镜
可以用普通的光学显微镜，通过一些特殊的方法观察菌液中细菌的活动情况。有条件的话还可以使用一些比较高端的显微镜，比如相差显微镜等。
2.使用半固体培养基进行培养
有鞭毛的细菌可沿穿刺线扩散生长，穿刺线周围会变模糊；无鞭毛的细菌只能沿穿刺线生长，周围澄清透明。
3.鞭毛染色
使用特殊染料染色，以方便在显微镜下观察。
4.免疫学方法
通过抗原抗体反应，检测细菌鞭毛的存在。
细菌检测最直截了当的方法，是取标本在培养基上均匀分布，然后培养细菌。如果几天之后培养基上出现菌落，这就说明培养出细菌，可以通过显微镜的镜检判断是哪一种细菌，还可以应用各种抗生素对细菌进行耐药分析，从而指导抗生素的应用。这种检查关键之处在于标本的选择，如果有肺炎症状，应该取痰培养。如果有寒战、怕冷、发热的症状，应该取血液培养。如果有尿频、尿急、尿痛，应该取尿液进行细菌培养。
答：简述细菌检测的方法及优缺点：可以直接用显微镜观察其运动情况。另外，鞭毛是细菌的运动器官，因此还可以通过检测细菌鞭毛的存在来间接判断细菌是否具有动力。记忆中的方法有这些：1.使用显微镜 可以用普通的光学显微镜，通过一些特殊的方法观察菌液中细菌的活动情况。有条件的话还可以使用一些比较高端的显微镜，...
答：细菌直接涂片计数法的优点是所需设备简单、快速得到结果等，缺点是难以准确地测量小型细胞等。1、所需设备简单：使用该方法进行细菌计数所需的实验设备相对简单，不需要复杂的仪器和特殊试剂。2、快速得到结果：与其他繁琐的细菌计数方法相比，直接涂片计数法可以迅速获得初步结果。3、难以准确地测量小型细胞：...
答：细菌总数检测纸片的研制始于 20 世纪 80 年代，其主要优点是简便、实用、经济、操作性强。近年来以滤纸和美国某公司的 Petrifilm 为载体的测试片已开始被广泛应用。2、生物电化学方法 生物电化学方法是指通过电极测定微生物产生或消耗的电荷，从而提供分析信号的方法。微生物在滋生代谢过程中，培养基的电...
答：优点：简便易行，不需要特殊设备，一般实验室都可完成。缺点：测定的菌落数与单位体积的空气量中的细菌（微生物）数的对应关系受很多条件的影响。用统一的经验公式换算有一定误差。沉降法是利用带微生物的尘粒或液滴因重力自然落在培养基表面来测定的。
答：(三)实验方法 1.将伤寒杆菌,大肠杆菌按照液体接种方法分别接种于葡萄糖及乳糖发酵管内. 2.置37℃孵箱培养18-24小时. 3.观察结果:由于一些细菌能分解某种糖类产酸,所以培养基中pH下降到7.0以下,在酚红指示剂的显示下,培养基颜色由红变黄.产酸者以“+”表示,如果同时产生气体,则培养基中小倒管内有气泡出现...
答：细菌检验方法:如果经营出口食品,那就必须遵守进口国的相关法律和标准,所以标准是否合理不能用我国的标准衡量,而要看是否符合进口国的标准,你最好向进口方索要相关的采样和检验方法,按照他们的标准做,免得误事。2、面积是指涂抹面积而不是培养基面积。3、检验结果出现小数是可能的,因为采样结果计算公式:细菌总数(cfu...
答：传统检测有三种方法1、直接显微镜观察，正常情况，在一定的培养条件下（相同的培养基、温度以及培养时间），同种微生物表现出稳定的菌落特征。可以通过显微镜观察菌落特征对微生物种类进行判断。2、选择培养基培养微生物或人为提供有利于目的菌株生长的条件，选择培养基，其作用是允许特定种类的微生物生长，同时...
答：动物实验用灭菌生理盐水将病料做成1:10悬液，或利用分离培养获得的细菌液感染实验动物，如小白鼠、大白鼠、豚鼠、家兔等。感染方法可用皮下注射、肌内注射、腹腔注射、静脉注射或脑内注射。感染后按常规隔离伺养管理，注意观察，有时还须对某种实验动物测量体温；如有死亡，应立即进行剖检及细菌学检查。
答：家兔法和细菌类毒素法的优缺点:1、家兔检测法优点:最早作为热原检测法的家兔检测法也就成为人们检测内毒素的最早方法，将一定量的被检标本静脉注入家兔体内，观察其注射后的发热情况，以决定所检标本中有无热原存在。缺点:家兔检测法为一种定性检测内毒素的方法，家兔法局限性日益突出。如家兔对内毒素在...
