求助，荧光定量PCR扩增曲线和溶解曲线
荧光定量pcr的溶解曲线理解：用Syber Green方法做完PCR后，用来判断产物是否相对专一。应结束后，逐渐加温。和Syber Green分子结合的PCR产物随温度升高逐渐变为单链，就不能在和Syber Green结合。
一般每加温一度，读一次信号。当温度到达PCR产物的Tm时，产物解离一下增多。曲线的横坐标是温度，而纵坐标是荧光信号的变化，开始加热，信号变化不大，所以几乎是平的。
接近Tm时，突然变化加大，所以出现峰值。再升温，产物全部解离，就又是一条直线了。如果有非特异性产物，在加热过程中就会出现一些比较矮，宽的峰。
扩展资料：
荧光定量pcr通过荧光信号不断累积而实现实时监测PCR全程，然后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在实时荧光定量PCR中，对全程PCR扩增过程进行实时检测。
根据反应时间和荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号标准偏差的10倍。
熔解曲线分析可以用来确定不同的反应产物，包括非特异性产物。熔解温度上有一特征峰（Tm，DNA双链解链50%的温度），用这个特征峰就可以将特异产物与其它产物如引物二聚体区分开，因为它们在不同的温度熔解线，随着反应中双链DNA变性。
参考资料来源：百度百科-荧光定量PCR
参考资料来源：百度百科-溶解曲线
荧光定量pcr的溶解曲线理解：用Syber Green方法做完PCR后，用来判断产物是否相对专一。应结束后，逐渐加温。和SyberGreen分子结合的PCR产物随温度升高逐渐变为单链，就不能在和SyberGreen结合。
出现怪异的溶解曲线大部分都是机器设置或者反应体系的问题，建议：
1、将扩增产物跑一下电泳，看一下目的条带亮不亮
2、一般定量PCR扩增后目的片段的峰在80~90℃之间，反应条件确认一下设置是否有问题
3、适当增加模板量或者减少引物浓度。
技术原理
将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光；
随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。
以上内容参考：百度百科-实时荧光定量PCR
答：可以用于正式实验的引物必须满足以下条件：a 溶解曲线单峰，窄而尖，否则可能有非特异性扩增；峰的位置横坐标一般在80度以上，这个温度为PCR产物的解链温度，如果在75度附近，可能是引物二聚体，miRNA染料法检测时，溶解曲线的峰的位置可能在75度附近 b 琼脂糖电泳为明亮的一条带，条带一般在100bp以上...
答：接下来，我们具体来看看实验的细节。设置扩增曲线的基线，确保从高于背景水平的循环开始，每个靶基因需要独立的基线处理。现代软件可帮助优化基线设定，PCR的初始循环应在荧光信号稳定后开始。为了得到准确的信号，需要减去非特异性荧光和信号分量，通过报告基因信号进行归一化。在设置阈值时，通常选择在扩增曲线...
答：是的。溶解曲线只有上升支扩增产物的Tm值较高，可在设置溶解曲线时将95度改为99度（图片来自我p的）最后还是本人的碎碎念~qPCR是比较基础的实验。
答：实时荧光定量PCR数据分析及常见问题分析一、数据分析定量PCR扩增曲线的各种概念一、数据分析什么是基线•基线是扩增曲线的水平部分。一、数据分析基线扣除一、数据分析什么是阈值•阈值是一个荧光强度值，穿过阈值与X轴平行的直线称为阈值线。一、数据分析什么是Ct值•Ct值是阈值线与扩增...
答：荧光定量PCR 实验步骤： ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA...
答：NTC扩增现象表明可能存在的污染问题。图4揭示了污染可能带来的影响。为防止污染，务必保持工作台清洁，使用预混液降解前序反应产物，更换反应管，甚至在不同实验地点进行实验。通过这些细致的步骤，确保实验数据的准确性。优化实时荧光定量PCR的过程虽然繁琐，但每一次细致的操作和调整，都是为了提升数据的敏感...
答：检测方法 1.SYBRGreenⅠ法：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR定量PCR扩增荧光曲线图 PCR产物熔解曲线图（单一峰图表明PCR扩增产物的单一性...
答：看这个结果有几个猜想：1)如果之前做实验的时候，仪器没有出现过这种情况，有可能是仪器出现错误，建议重启一下，或者改软件需要重新校准一下。2)从这个结果来看，引物应该是可以用的，主峰也只有一个，特异性还是有的，不过还要参考一下扩增曲线，Ct值如果在35个循环以内，应该是没有问题的。
答：采用相对法定量要求必须目的基因和内参具有相同的扩增效率,所以需要做efficiency curve如果得到的斜率小于0.1,可以采用相对法,否则,需要重新设计能达到相同扩增效率的引物,或者就需要制作标准曲线,制作标准曲线,可以将基因片段克隆到质粒,然后体外转录成rna,定量以后合成cdna,然后按比例稀释后做出标准曲线,或者...
答：荧光定量的溶解曲线主要是看是否存在非特异性扩增如引物二聚体等，当只有单一峰时且值在退火温度说明特异性扩增，结果可用
