请教酶切位点和测序结果不一致问题

请教各位我设计引物加了酶切位点和六个保护碱基，结果扩出来的片段短了，缺少我之前设计引物那段互补片段

你看看新加进去的酶切位点和保护碱基是不是能和你的基因片段匹配，如果匹配程度高的话，或者引物内部产生颈环结构的话，可能会造成扩增产物的异常。

1）酶应该是够的，如果怕，就多加一点。但问题是如何保证他们能够把所有的两个AB位点都切开，如果切不开。那你的片断就多了一截。所以建议最后测序验证你的clones。2）你序列的方向需要验证，因为TA克隆是随机插入到载体里面的。所以先用一个载体引物和你的insert引物配对检测得到正确方向插入的clones。3）PCR酶切的效果当然不如在质粒上切，我曾经也这样干，效果不好。现在不这样干了，直接放到载体上切吧。也多花不了多少间。

酶切位点检测质粒的正确性只能从目标片段的大小上判断，因此准确性比较差，另外，如果酶切反应体系或者条件的不适合，会导致切割效率低下或者产生星标活性（即产生错误切割）。测序的结果一般来讲是可信的，但是要注意在测序反应刚开始和接近结束时，其结果的可信性差，可以查看测序峰图用来确认。

关于BstEII酶切位点可变碱基的问题
答：N的位置是错配的，因为粘性末端有5bp，一个碱基的错配仍然可以连接成功。存在错配的质粒被转入大肠杆菌后，错配位置被修复。原则上存在两种情况，N为G或N为T，参考原核生物DNA修复机制，两者的概率可能有差异。因此你测序要原序列是正常的。

怎么查看基因测序结果中克隆的酶切位点
答：第一，酶切位点，由内切酶决定，内切酶的使用是人为决定的，所以酶切位点首先应该是人为设计出来。第二，设计好酶切位点，然后合成引物，购买质粒。第三，如果PCR完成，可以用相应位点的内切酶，切割基因，电泳，根据电泳结果，判断该位点是否存在或者酶切是否正确。

载体构建中,引物设计序列与克隆测序不一致,向您请教!
答：第一个问题，只有一个碱基缺失，克隆测序和引物合成都没有问题；第二个问题：酶切连接入载体后，克隆过程就完成了；第三个问题：如果你说的是转化过程的话，应该是先做好连接，再做转化。

请教各位我设计引物加了酶切位点和六个保护碱基,结果扩出来的片段短了...
答：你看看新加进去的酶切位点和保护碱基是不是能和你的基因片段匹配，如果匹配程度高的话，或者引物内部产生颈环结构的话，可能会造成扩增产物的异常。

有没有人反向PCR以后,连到载体上,测序发现:只有引物正确,其它的都不是...
答：PCR得到的产物去做测序，结果里肯定会有引物序列的，那些条带都是引物起始扩增才得到的啊。你的PCR可能发生了错配，而且挑去测序的克隆恰好是非特异性扩增的产物。酶切位点位置不确定，PCR产物大小也就不确定，要得到正确的扩增结果，你需要建立一个筛选方法，从AT克隆中初步筛一下，否则测序的量会很大...

...菌液pcr后电泳有目的条带,为什么送菌液测序结果是空载体呢 ?_百度...
答：1、你的实验目的是什么？ 2、如果是克隆，连接T载体后不用酶切，直接转化菌落pcr检测有目的条带的话送样测序即可。 3、如果是做表达载体构建，pcr产物和质粒DNA酶切后与没有酶切的在同一块胶上电泳，如果两个酶切位点很近，几乎看不到被切下来的小片段条带（太小，早就跑出去了）。你要是怕...

DNA 酶切如何选择限制性内切酶,酶切后测序可以进行鉴定吗?
答：有专门的软件可以寻找DNA序列段上的酶切位点。有酶切鉴定，有测序鉴定，酶切一般是初步鉴定，如果是某DNA段最好以测序结果为准。

克隆测序结果如何分析
答：首先确认你克隆的位点，如果是酶切做的话，找到酶切位点看你的目的基因有没有接进载体 如果是同源重组就找你设计的同源B 如果有基因接进去再和你的基因进行比对就行了，看看序列有没有突变什么的

我要求5’到3’正向测序,为什么你们给我的序列是反的?
答：我们只能根据质粒上的 序列来确定测序方向，所以在测序引物一栏中请不要使用3’引物和5’引物这样的字样，因为我们手中的资料在注明方向时可能和您手中的资料方向相反，请以T7，T3，SP6，M13f，M13r这样的形式来 填写，或注明酶切位点方向比如“测序方向EcoRI到HindIII”。我们手中等质粒资料有限，有时...

...是3039bp,酶是Pst1,T3上只有一个酶切位点,用的mark是Trans5K DM...
答：，pst1酶切处理目的片段和puc19载体（可以继续用碱性磷酸酶处理酶切后的puc19，防止载体自连，用该连接产物转化大肠杆菌感受态。） 2，用T4连接酶连接酶切后的puc19和目的片段。 3，涂布于氨苄抗性平板 4，挑取单菌落进行PCR验证目的片段，测序