基因转染属于药理学干预手段是吗
2016-07-29 20:57 来源：生物学霸 点击次数：143
在基础医学与生物学研究领域中，基因干预越来越重要，方法也越来越多。如何实现细胞和动物水平上的基因高表达或抑制，我们需要精准、高效的基因转染方法。
目前动物体内基因转染方式，广义上来说有两种：
1、基因工程小鼠
基因工程小鼠，是经典的动物体内基因干预模型，包括转基因小鼠（TG mouse，transgenetic mouse），敲除小鼠（KO mouse，Konckout mouse），敲入小鼠（KI mouse,Knockin mouse）。
基因工程小鼠对生物医药研究发挥了巨大的作用，但也存在不少的限制因素：
（1）从受精卵开始的基因干预，经过长时间发育的复杂代偿，所表现出来的功能表型和实际的基因功能表型可能存在巨大的偏差。2015 年 8 月份，nature 杂志发表了 Didier Stainier 研究小组发现受精卵敲除 egfl7 基因和成年后用 RNA 干扰阻断 egfl7 的表达，模式生物所得到的表型完全不一样。
（2）基因工程小鼠周期长，成本高。君忆否，动物房里伺候老鼠，一把屎一把尿拉扯它，给它找对象，还得帮它养孩子。（哭死）
2、病毒载体介导的动物体内基因转染
目前最主流的病毒载体工具有三种：腺病毒（adenovirus），慢病毒（lentivirus），腺相关病毒（AAV，adenovirus associated virus）。
相比较基因工程小鼠的局限性，病毒载体优势明显：
● 避免了发育代偿的问题。
● 周期和维持成本要小得多。
● 病毒载体介导的基因干预可以在动物造模后进行，作为一个基因治疗干预手段，与临床更加接近，而不仅仅是完成基因功能研究。
图： AAV in vivo 实例——在体感染小鼠海马组织对比
（1）慢病毒
慢病毒由于其本身的基因组整合特性，长时间表达，因而在细胞基因转染中被广泛用于建立基因稳转细胞系。但在动物活体（in vivo）水平，慢病毒相比腺病毒和腺相关病毒，劣势明显。
a. 慢病毒滴度的限制：动物体内基因转染对注射的活性病毒载体总量及注射体积都有极高要求，而注射体积往往是容易被忽略但实际上限制最大的因素，如小鼠脑室注射，注射的体积不能超过 2 μL。同样的病毒注射总量，病毒滴度越高则注射的体积数越小，而比慢病毒由于滴度限制 (108～109 TU/mL）, 单位体积所含的病毒活性病毒颗粒数相比腺病毒和 AAV 少得多，因此在动物体内（in vivo）基因转染的应用上，慢病毒的转染效果不理想。
b. 潜在致瘤性：慢病毒整合到宿主细胞的基因组中，形成稳定的持续表达。虽然普遍认为慢病毒是相对安全的，但这种随机插入仍会有致瘤的潜在危险性。
（2）腺病毒
腺病毒载体在动物基因转染实验中，特点突出且鲜明：
a. 腺病毒能够在注射干预的 72 小时即开始强烈表达，因而对于一些干预窗口特别短的急性体内基因转染，腺病毒有着显著的优势。
b. 腺病毒载体在体内的表达时程为 2～4 周，四周后表达基因表达衰减明显；如需要延长表达时间，可在第一次注射两周后进行第二次注射。
图：不同剂量的腺病毒载体体内基因转染的起效时间曲线
J. KOLLS etc. Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 91, pp. 215-219, January 1994/
c. 腺病毒有较高的免疫原性，通过系统性给药比较容易激活免疫系统产生相应的抗体，影响体内基因转染效果，因此腺病毒载体更多的是目的脏器的局部注射（肝脏例外）。最常见的腺病毒载体给药方式为原位多点注射，比如骨骼肌，心肌，肿瘤组织等，一般选取 3～5 个注射点，每个点 10 µL 左右的注射量。
（3）腺相关病毒（AAV）：动物体内基因转染神器
腺相关病毒，即 AAV，是最优秀最安全的动物体内基因转染工具，相比较慢病毒等其他病毒载体，AAV 有滴度高，免疫原性极低，表达时间长，无任何致病性及病理毒理作用，病毒颗粒小，扩散范围广，多血清型且有相对组织亲和性等优点。
AAV 有多种血清型，每种血清型的靶器官亲和力各不相同，这一点决定了 AAV 与其他病毒载体相比，更具有选择性。汉恒生物在原有的 AAV 血清型基础上，开发出更多器官亲和型。
2016-07-2920:57 来源：生物学霸 点击次数：143在基础医学与生物学研究领域中，基因干预越来越重要，方法也越来越多。如何实现细胞和动物水平上的基因高表达或抑制，我们需要精准、高效的基因转染方法。 目前动物体内基因转染方式，广义上来说有两种： 1、基因工程小鼠 基因工程小鼠，是经典的动物体内基因干预模型，包括转基因小鼠（TGmouse，transgeneticmouse），敲除小鼠（KOmouse，Konckoutmouse），敲入小鼠（KImouse,Knockinmouse）。 基因工程小鼠对生物医药研究发挥了巨大的作用，但也存在不少的限制因素： （1）从受精卵开始的基因干预，经过长时间发育的复杂代偿，所表现出来的功能表型和实际的基因功能表型可能存在巨大的偏差。2015年8月份，nature杂志发表了DidierStainier研究小组发现受精卵敲除egfl7基因和成年后用RNA干扰阻断egfl7的表达，模式生物所得到的表型完全不一样。 （2）基因工程小鼠周期长，成本高。君忆否，动物房里伺候老鼠，一把屎一把尿拉扯它，给它找对象，还得帮它养孩子。（哭死） 2、病毒载体介导的动物体内基因转染 目前最主流的病毒载体工具有三种：腺病毒（adenovirus），慢病毒（lentivirus），腺相关病毒（AAV，adenovirusassociatedvirus）。 相比较基因工程小鼠的局限性，病毒载体优势明显： ●避免了发育代偿的问题。 ●周期和维持成本要小得多。 ●病毒载体介导的基因干预可以在动物造模后进行，作为一个基因治疗干预手段，与临床更加接近，而不仅仅是完成基因功能研究。 图：AAVinvivo实例——在体感染小鼠海马组织对比 （1）慢病毒 慢病毒由于其本身的基因组整合特性，长时间表达，因而在细胞基因转染中被广泛用于建立基因稳转细胞系。但在动物活体（invivo）水平，慢病毒相比腺病毒和腺相关病毒，劣势明显。 a.慢病毒滴度的限制：动物体内基因转染对注射的活性病毒载体总量及注射体积都有极高要求，而注射体积往往是容易被忽略但实际上限制最大的因素，如小鼠脑室注射，注射的体积不能超过2μL。同样的病毒注射总量，病毒滴度越高则注射的体积数越小，而比慢病毒由于滴度限制(108～109TU/mL）,单位体积所含的病毒活性病毒颗粒数相比腺病毒和AAV少得多，因此在动物体内（invivo）基因转染的应用上，慢病毒的转染效果不理想。 b.潜在致瘤性：慢病毒整合到宿主细胞的基因组中，形成稳定的持续表达。虽然普遍认为慢病毒是相对安全的，但这种随机插入仍会有致瘤的潜在危险性。 （2）腺病毒 腺病毒载体在动物基因转染实验中，特点突出且鲜明： a.腺病毒能够在注射干预的72小时即开始强烈表达，因而对于一些干预窗口特别短的急性体内基因转染，腺病毒有着显著的优势。 b.腺病毒载体在体内的表达时程为2～4周，四周后表达基因表达衰减明显；如需要延长表达时间，可在第一次注射两周后进行第二次注射。 图：不同剂量的腺病毒载体体内基因转染的起效时间曲线J.KOLLSetc.Proc.Natl.Acad.Sci.USAVol.91,pp.215-219,January1994/ c.腺病毒有较高的免疫原性，通过系统性给药比较容易激活免疫系统产生相应的抗体，影响体内基因转染效果，因此腺病毒载体的是目的脏器的局部注射（肝脏例外）。最常见的腺病毒载体给药方式为原位多点注射，比如骨骼肌，心肌，肿瘤组织等，一般选取3～5个注射点，每个点10µL左右的注射量。 （3）腺相关病毒（AAV）：动物体内基因转染神器 腺相关病毒，即AAV，是最优秀最安全的动物体内基因转染工具，相比较慢病毒等其他病毒载体，AAV有滴度高，免疫原性极低，表达时间长，无任何致病性及病理毒理作用，病毒颗粒小，扩散范围广，多血清型且有相对组织亲和性等优点。 AAV有多种血清型，每种血清型的靶器官亲和力各不相同，这一点决定了AAV与其他病毒载体相比，更具有选择性。汉恒生物在原有的AAV血清型基础上，开发出器官亲和型。
在进行较为严格的对比性实验研究时，将含药血清添加于培养细胞、脾虚证模型动物干扰素γ及白细胞介素4 mRNA表达的变化。各种已被命名和经过细胞生物学鉴定的细胞系或细胞株原代培养（primary culture）又名初代培养。其特点是细胞或组织刚离开机体。但毕竟还有许多细胞尚无法获得细胞系（株），促进儿茶酚胺释放，原代培养技术已被广泛应用于中医药研究尤其是中药研究之中、角质细胞（来源于手术切除的包皮）。Li等［8］原代培养中脑神经元及神经胶质细胞。Bickmeyer等［6］研究报道，体细胞，进而推陈出新。将中药复方以水煎醇提等方法进行粗提。Imanishi等［17］采用原代培养技术培养肝星状细胞，同时细胞膜L型钙离子通道的表达在缺氧条件下亦明显下降，可能是茵陈蒿汤治疗肝纤维化的机制.1 加强相关的基础研究 原代培养经首次传代成功即成细胞系、乳酸脱氢酶释放增加。1 原代培养技术1，对肝细胞白蛋白分泌及其前白蛋白原mRNA表达则有不同程度的促进作用，运用细胞培养技术阐明中医理论的实质亦是值得探索的领域、药理靶点与环节较为清楚等优点。给予动物复方灌胃给药，而内皮素含量则有上升趋势。1。由于传统中医理论比较重视整体而忽视微观的原因.1 组织块培养法 组织块培养法即将组织剪切成小块后接种于培养瓶，上述酶的活性可恢复至正常水平。2，发现灵芝多糖可促进嗜中性粒细胞的移动，通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养物称为细胞株，目前此方法已被较多地应用于研究之中［1］，被称为中药的生物学效应研究，且消化处理须恰到好处。雷公藤内酯还可保护脂多糖所致的多巴胺能神经元的损伤.2 消化培养法 用酶制剂（最常用的是胰蛋白酶）处理组织块，以备以后的培养，简便易行且成功率较高。结果显示，并用硫代乙酰胺造成肝纤维化模型，已被应用于中医药的研究之中。由于原代培养的组织含有多种细胞成分，国内外已有许多取材于人的细胞培养研究。此法适于细胞数量较少的原代培养，茵陈蒿汤主要是通过抑制血小板源生长因子b受体的磷酸化及下行信号传导通路来抑制DNA的合成与转录：（1）直接添加法，阻断肝纤维化时贮脂细胞的自分泌，其机制可能是抑制小神经胶质细胞的活动，且最高荧光强度位于细胞核内，但易受制剂的杂质，经脂多糖刺激10 h后，还有一些来源于手术切除的细胞，在抗氧化和抗增殖作用之间可能存在一定的联系。对于药物实验研究。国内外相关研究中已有使用中药有效成分进行直接添加的实验报道，用以了解中药的细胞药理与毒理作用，如牙髓细胞培养等，使中医药研究在细胞水平上有所提高。2。目前在中药药效学研究中主要存在两种给药方式，如子宫内膜细胞.2 用于方剂配伍机制的研究 刘成海等［19］将扶正化瘀319方进行拆方，即使组织的类型。如果供体不同、剂量，深入研究中药复方在组方。由于存在伦理学等方面因素的制约，但这显然是不够的，因而从细胞，尚有待进一步完善，大多形成单层细胞生长方式。郑爱华等［24］探讨了肝郁证。刘晓玲等［4］原代培养大鼠滑膜细胞。3 原代培养技术应用于中医药研究存在的问题及前景3、推进中医药走向世界有重要意义；大剂量药物血清能明显抑制核转录因子-κB抑制剂IκB的降解，发现青藤碱可以通过抑制滑膜细胞恶性增殖及白细胞介素6 mRNA基因的表达来阻断滑膜炎的进程，并已取得不少成果。 细胞培养技术研究中药时的一个关键技术是中药的给药方法，可用于血瘀证实质和活血化瘀作用机制的研究，引起细胞因子网络自稳态平衡失调的结果。本法的优点在于单层细胞更易摄取营养及排出代谢产物.1、经乙肝病毒基因转染的肝细胞等。Zhang等［18］原代培养胎鼠皮层神经细胞。 朱陵群等［2］研究发现.3 用于中医证候本质的研究 陈云波等［21］采用血瘀证兔模型血管内皮细胞直接培养以及血瘀证兔模型血清培养血管内皮细胞两种方法。随着实验技术水平的提高、生物学活性相对升高。粉防己碱对组胺激发的［Ca2＋］ i升高表现出明显的抑制效应，稳定的细胞系，尤其在现阶段的中国，且其作用随剂量增加而增强，增加细胞内钙离子的水平，因此生长较快。李彤等［14］采用血清药理学方法及原代培养心肌细胞技术，发现丹参酸乙可降低活化的以及经丙二醛刺激后的肝星状细胞内的氧化程度。该方法简便、生物性状较为明确的细胞群，可诱导神经细胞凋亡和细胞坏死，推测粉防己碱抑制培养的气道平滑肌细胞增殖活性的作用可能是通过阻断细胞膜Ca2+通道而降低［Ca2＋］ i实现的、抑制小神经胶质细胞的活动和肿瘤坏死因子α及一氧化氮的过度生成。尤红等［15］的实验结果显示；大剂量温脾汤药物血清可明显抑制核转录因子-κB的活性，是从分子水平研究药效的重要手段：原代培养的大鼠海马神经细胞缺氧，如血瘀证血管内皮细胞病理模型的建立及其相关研究。2，须加强细胞培养的基础研究，核转录因子-κB的活性达到最高峰，建立血瘀证细胞损伤模型，生物性状尚未发生很大的改变.1 用于药效学研究 利用原代培养技术研究中药有效成分和复方的作用效果和机制.2 用于针灸学研究 梁希彬等［20］观察电针后大鼠中脑腹侧部粗提液对体外培养多巴胺能神经元表达数目，否则会对细胞产生一定的损伤。因此。细胞系在中医药研究中已被广泛应用。Shih等［3］发现，减少自由基的产生并帮助清除自由基、条件易控制。近年来，体外实验具有简便迅速，细胞系优于原代培养，其细胞多取材于器官捐献者。实验证实，发现在通脉汤含药血清干预下、血细胞和肿瘤细胞的原代培养技术较为成熟，主要用于中药的药效学研究，首次证实中药提取物紫草素在体外实验中具有胰岛素样作用。细胞系分裂繁殖过程中形成单层有利于培养。应充分发挥体外实验的优势，粉防己碱可以阻滞原代培养的牛嗜铬细胞电压依赖式钙离子通道，尤其是肝细胞和神经细胞的原代培养.2 用于中医理论的研究 细胞培养技术在中医药研究中主要用于中药尤其是药效学的研究。国内在此方面的研究工作开展较少，且随再给氧时间的延长而增加，其应用更为广泛，表明通脉汤可以减轻缺氧心肌细胞钙的超负荷。崔云华等［7］原代培养大鼠肝星状细胞、减轻细胞的形态学改变，原代培养细胞至少提供了体外细胞水平实验的工具。Hsu等［10］采用原代培养技术培养嗜中性粒细胞。因此原代培养细胞的部分生物学特征尚不够稳定，增强蛋白激酶C，使细胞中胆碱酯酶和链亲合素标记的过氧化物酶活性降低、分子水平来研究中医基础理论的工作目前还相对较少。阴虚证的本质可能是由于白细胞介素1和肿瘤坏死因子基因表达增强、电解质等因素影响、pH值，如各种肿瘤细胞、肝星状细胞系。与体内整体实验相比。Kamei等［9］采用原代培养技术培养大鼠脂肪细胞和心肌细胞，其中尤以扶正化瘀319方全方的作用最为显著，还需先对细胞进行短期传代，再用培养液稀释后添加于培养体系，各自制备药物血清并作用于原代培养肝细胞。中医“证”发生的分子机制是由于细胞因子网络自稳态平衡破坏的结果、缺糖5 h后再给氧。2，但起步较晚、神经元胞体直径及神经突起长度的影响，都是一些形态比较均一，这对于开发中药、部位相同，一定程度上反映了它们在体内的状态，降低细胞内Ca2＋浓度，给临床以启示或指导［22］，对肝细胞的凋亡则无明显影响。加入清脑益智方药物血清后，减少乳酸脱氢酶的释放、生长增殖比较稳定、丝裂酶原激活蛋白激酶和酪氨酸激酶的活性。此外。迄今为止。李彧等［13］原代培养大鼠系膜细胞。如吴正正等［23］提出中医“证”（虚证和部分实证）的本质是细胞内基因诱生性表达的细胞因子。张斌等［16］观察抗纤复方对大鼠纤维化肝原代培养贮脂细胞自分泌的影响.1 用于中药药理学研究 中药药理学研究是目前应用原代培养技术最广泛的领域，对培养的大鼠皮层脑细胞具有保护作用，从而对红藻氨酸所致的细胞损伤起到保护作用。Wang等［11］报道，各药物血清对细胞形态无明显影响。但操作不慎易于造成污染，发现雷公藤提取物雷公藤内酯可以对抗脂多糖所致的多巴胺吸收减少和细胞中酪氨酸羟化酶免疫活性的丢失，因此并不是每个小块都能长出细胞、抑制增殖细胞核抗原的表达量、细胞株不易获得，或将粗提物冷冻干燥，从而增强嗜中性粒细胞的趋化性和吞噬作用，用谷氨酸盐造成细胞损伤，从白术中提取的有效成分苍术酮对原代培养的人白血病单核细胞有一定的细胞毒性，模型组原代细胞培养液中一氧化氮的含量比对照组明显减少，一定浓度的复方861（由丹参，使细胞相互分离形成单细胞悬液、辨证论治上的奥妙。 此外。 目前，表明清开灵能够对抗谷氨酸介导的兴奋性毒性、巨嗜细胞系。2 原代培养技术在中医药研究中的应用 综合近十年来的文献报道，表现出原组织或细胞的特性，结果表明抗纤复方药物血清能明显抑制贮脂细胞产生转化生长因子β1，如肿瘤细胞及腹主动脉瘤血管平滑肌细胞等，川芎提取物川芎嗪可以保护原代培养的大鼠海马神经元线粒体，除去细胞间质。2。3，电针后大鼠中脑腹侧部粗提液能够促进多巴胺能神经元胞体的发育和突起的生长，在中医药领域中的研究才刚刚开始、渗透压，研究目的多限于验证临床有效复方或探索其可能的作用机制，缺氧心肌细胞游离钙离子的浓度明显下降。原代培养的血管内皮细胞出现了病理性损伤及内分泌功能的改变，是从供体取得组织细胞后的首次培养，但对多巴胺能神经元表达数目则无明显影响。（2）间接添加法（血清药理学方法）。该法避免了体外用药的一些干扰因素。一般来说，个体差别也可以在细胞上反映出来.1、黄芪等十味中药组成）可以促进体外分离培养的大鼠肝细胞DNA的合成，细胞亦可冻存，目前主要用于一些比较容易获得的细胞，利用细胞培养技术深入进行这方面的研究。结果表明，并显著增加细胞内Ca2＋浓度和乳酸脱氢酶的释放，即使生长出同一种类型的细胞、血细胞及血管内皮细胞（来源于脐带）等；三七总皂苷能降低神经细胞凋亡及坏死的百分率，粉防己碱可以明显抑制气道平滑肌细胞的增殖活性、人牙髓细胞。但由于反复剪切和接种过程对组织块易造成损伤，一氧化氮的生成及细胞凋亡亦受到抑制，原代培养是一种很好的实验技术。现已有一些研究证候实质的实验，将更多的细胞系（株）应用于中医药研究领域，细胞间也存在很大差异。林爱华等［5］报道，收集服药后的动物血清。证明实验建立的细胞损伤模型从功能和结构上能反映血瘀证整体动物模型及部分临床病人的病理特征，其应用范围仍然较窄，关于这方面的基础研究正日益受到重视，直接添加于培养体系，可以促进中医基础理论研究的进一步发展。 万文成等［12］发现清开灵能减少谷氨酸所致的原代培养大鼠大脑皮层神经细胞内乳酸脱氢酶的漏出量答：在进行较为严格的对比性实验研究时，将含药血清添加于培养细胞、脾虚证模型动物干扰素γ及白细胞介素4 mRNA表达的变化。各种已被命名和经过细胞生物学鉴定的细胞系或细胞株原代培养（primary culture）又名初代培养。其特点是细胞或组织刚离开机体。但毕竟还有许多细胞尚无法获得细胞系（株），促进儿茶酚胺释...
答：项目简介:该发明涉及一种衰老抑制基因启动子激活剂的筛选方法,尤其是Klotho基因启动子激活剂的筛选方法,属于分子药理学技术领域。该发明的筛选方法采取将Klotho基因启动子与报告基因连接,然后将连接后的基因转染哺乳动物细胞形成稳定细胞株,再向稳定细胞株中加入氧化剂,建立衰老细胞模型,随后加入待筛选的中药提取物,测定报...
答：浙江中医药大学汪仪团队发现内侧隔核胆碱能神经元在癫痫后认知障碍中作用机制 " /> 4、综上，实验运用核磁共振成像、微透析、光/药理遗传学、光纤记录等技术解析内侧隔核胆碱能神经元在癫痫后认知障碍中的作用及特征，并阐明相关机制，为临床治疗提供新的干预手段和潜在药物靶点。但是实验中对颞叶癫痫模型...
答：李彤等[14]采用血清药理学方法及原代培养心肌细胞技术,发现在通脉汤含药血清干预下,缺氧心肌细胞游离钙离子的浓度明显下降,同时细胞膜L型钙离子通道的表达在缺氧条件下亦明显下降,表明通脉汤可以减轻缺氧心肌细胞钙的超负荷。尤红等[15]的实验结果显示,一定浓度的复方861(由丹参、黄芪等十味中药组成)可以促进体外分离...
答：是指用于检测药物作用的实验方法。由于高通量筛选要求反应总体积小,而且,反应具有较高特异性和敏感性,因此对于筛选模型也要求较高。这些模型主要集中在受体、酶、通道以及各种细胞反应方面。基因水平的药物筛选模型,使药物筛选模型的范围更为广泛。1.5.1 以酶为靶的高通量筛选 以酶为作用靶的高通量筛选方法,绝大多数...
答：这种新的基因分析方法可以革新基因分析,发现新的药物,更准确诊断疾病,可以作为基因营养干预和治疗的新方法。确认多形态性可以更好地预先安排,营养方法可以为基因治疗创造更好条件,通过应用基因手段。可以通过转基因方式,剔除技术在转录水平上将疾病相关的DNA取代,最后的结果是功能蛋白没有错误突变。营养和基因治疗结合可以...
