无血清培养基的使用方法

无血清培养基和试剂被广泛的应用于培养哺乳动物和无脊椎动物细胞以制备单克隆抗体，病毒抗原和重组蛋白等。大多数的无血清培养基含有向细胞内转运离子的转铁蛋白和调节葡萄糖摄取量的胰岛素，以及一些蛋白质和清蛋白，纤维蛋白，胎球蛋白等，这些蛋白在细胞培养中发挥各种不同的功能，如提供细胞贴壁所需的基质，抗生物反应器剪切力，作为脂质和其他生长分化因子的载体等。

1.可避免血清批次间的质量变动，提高细胞培养和实验结果的重复性。
2.避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染。
3.避免血清组分对实验研究的影响。
4.有利于体外培养细胞的分化。
5.可提高产品的表达水平并使细胞产品易于纯化。

目前，血清仍是动物细胞培养中最基本的的添加物，尤其是在原代培养或者细胞生长状况不良时，常常会先使用有血清的培养液进行培养，待细胞生长旺盛以后，再换成无血清培养液。细胞转入无血清培养基培养要有一个适应过程，一般要逐步降低血清浓度，从10%减少到5%，3%，1%，直至无血清培养。在降低过程中要注意观察细胞形态是否发生变化，是否有部分细胞死亡，存活细胞是否还保持原有的功能和生物学特性等。在实验后这些细胞一般不再继续保留，很少有细胞能够长期培养于无血清培养基而不发生改变的。细胞转入无血清培养之前，要留有种子细胞，种子细胞按常规培养于含血清的培养基中，以保证细胞的特性不发生变化。
为了使细胞适应无血清培养，关键的是使所培养细胞：
1.处于对数生长中期
2.>90% 活细胞率
3.适应时以较高的起始细胞接种
细胞适应无血清培养基的方法
1.直接适应——细胞从添加血清的培养基转换到无血清培养基（SFM）中。
一些类型细胞可直接从包含血清的培养基适应无血清培养基。对于直接适应，接种细胞密度应该:2.5×10~3.5×10细胞/ml。当细胞密度达到1×10~3×10细胞/ml时，传代培养细胞。当细胞密度在培养4到7天后达到2×10~4×10细胞/ml时，细胞完全适应了无血清培养基。每隔3~5天，当细胞密度达到1×10~3×10细胞/ml，细胞活率在90%时，贮备的适应了无血清培养基的细胞培养物应该再次传代培养。
2.连续适应——分好几步把细胞从添加血清的培养基转换到无血清培养基（SFM）中，与直接适应相比较，连续适应趋向对于细胞更加温和一些。
（1）以2倍正常接种密度接种生长活跃的细胞培养物到75%有血清培养基：25%SFM 混合培养基中，传代培养。
（2）当细胞密度>5×10细胞/ml时，以2×10到3×10细胞/ml细胞密度，在有血清培养基：SFM为50∶50的混合培养基中传代培养。
（3）以2×10到3×10细胞/ml细胞密度，25%有血清培养基和75% SFM中传代培养。
（4）当细胞密度达到1×10到3×10细胞/ml（接种后4到6天），在100%SFM培养基中传代培养。
（5）每隔3到5天，当细胞密度达到1×10到3×10细胞/ml，细胞活率在90%时，贮备的适应了无血清培养基的细胞培养物应该再次传代培养。
建议备份前一次混合培养的培养物，直到每一次细胞适应了新的混合培养基。每一次减少血清前，可能需要在SFM/有血清混合培养基中进行几次传代。
在适应过程中，最好不要让细胞生长过度。这将增加选择亚群的可能性。需要注意，与有血清培养基相比，大部分SFM包含非常少的蛋白质，因而更易于受外界因素的影响。
细胞培养适应替代血清：许多细胞利用连续适应方法能很好的适应，用包含FBS的的培养基和包含有替代血清的培养基1∶1（v∶v）的混合培养基培养细胞。通过下列的混合培养基的方式，连续几代减少当前培养基的量：1∶2，1∶4，1∶16和100%替代培养基。每次适应改变血清比例时，传代细胞2到3次。
培养可以直接从FBS转换到替代血清。一开始就使用相同于FBS的浓度的替代物或血清，生长的延迟可能会发生，4允许进行2到3次的传代，使生长率恢复到以前的水平。
特别需要强调的是：配制无血清培养液必须使用高质量的水，如石英玻璃蒸馏器经三次蒸馏或超纯水净化装置制备的水。因为无血清培养基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保护细胞的大分子，既便水中的有毒物质含量甚微，也可能对细胞产生致死性损害。这是无血清培养能否成功的关键因素之一。