双酶切鉴定（或者测序）是否含有目的基因的时候，为何用pMD18-T载体？

TAKARA的PMD18-T载体可以用哪个通用引物验证？ 用了TAKARA的PMD18-T载体转入了目的片段，想用PCR验证下，

用M13R/F，
你看看说明书上就有，你自己在确认下，也可以问问测序公司。
可以用自己基因片段的引物，也可以用一个通用引物，一个自己目的片段引物。
最好是酶切鉴定

可以。
克隆基因最后这几步你是指什么？你将基因连到T载体上，测序验证对了，就行了。接下来构建载体什么的，直接可以用T载体上序列做模版了。

通常先分析一下目的基因上存在哪些常见的酶切位点,
再选择合适的克隆载体.保证你双酶切的位点在目的基因上不会出现.
PMD18-T克隆位点两侧的酶切位点比较多,很常用的.

因为你用TAQ酶进行PCR的话会在片段末尾加A 而这个载体可以直接连接末尾有A的片段 不需要酶切后连接 所以方便 明白了不

双酶切鉴定(或者测序)是否含有目的基因的时候,为何用pMD18-T载体?_百 ...
答：再选择合适的克隆载体.保证你双酶切的位点在目的基因上不会出现.PMD18-T克隆位点两侧的酶切位点比较多,很常用的.

为什么双酶切有目的片段测序却没有
答：可以在你原先的那两个酶切位点的外边再找其他两个酶切一下试试，看看符不符合条带大小。我也遇到相似的问题，用了其他的酶切了以后反而切出预期条带了。

求助双酶切质粒切开了,目的片段切不开
答：没有目的片段是么~双酶切另一个限制酶不好使~或者重组质粒上根本没连有目的基因~可以测序试试~

农杆菌转化法的步骤
答：5、组织块转移到筛选培养基上培养，选出阳性幼苗。检测方法根据实验目的不同而不同。可以用PCR扩增目的片段；如果有报告基因GUS、GFP等也可以进行染色或荧光观察。原理：选择一种特制的空质粒载体（如PBI121质粒载体），其上要求含有T-DNA边界序列（此处可参见词条双元表达载体系统），在序列之间含有复制原...

...2.1质粒载体了,酶切鉴定单、双酶切要用什么酶?
答：单酶切可以用BstX I,双酶切可以用Spe I和EcoR V。原则上，你做单酶切鉴定需要你的插入片段前后都有的这个酶切位点，因为你的片段里面已有EcoR I,所以这个酶不能用，因为会切断内部PCR序列。对于双酶切，考虑的则是PCR片段前后不是共有的酶切位点。原则上，酶切位点离你的目的片段越近越好。

原核表达载体的原核表达载体调控原件
答：（2）PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。 （1） 将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。（2）测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或...

氨氧化古菌(AOA)克隆测序问题求助
答：挑出几个菌落直接培养测序是不适当的.菌落中有很大一部分比例转进去的是空载体,没有成功连入目的基因片段.所以要多挑一些单菌落,培养后用菌液PCR或者提质粒后双酶切鉴定是否连入目的基因,选择成功连入目的基因（阳性克隆）的再拿去测序.你现在的测序结果,很有可能只是载体本身的序列.dna测序过程，其实是...

克隆后测序后序列问题
答：挑出几个菌落直接培养测序是不适当的。菌落中有很大一部分比例转进去的是空载体，没有成功连入目的基因片段。所以要多挑一些单菌落，培养后用菌液PCR或者提质粒后双酶切鉴定是否连入目的基因，选择成功连入目的基因（阳性克隆）的再拿去测序。你现在的测序结果，很有可能只是载体本身的序列。

双酶切之后,连接载体与片段,转化到TOP10中,菌落长得很好,为什么鉴定不...
答：电泳就能检测酶切是否成功，酶切后电泳看看能不能跑出你要的目的条带。你的菌落要进行阳性筛选后才能进行鉴定，不知你有没有筛选。当然筛选出假阳性也很有可能。

如何用双酶切鉴定外源DNA在重组质粒中的插入方向,说说其原理并用图...
答：在基因插入的邻近末端部位选择一个单酶切点( B ),在载体上选一个单酶切点( A ),用这两个内切酶分别酶切两份重组质粒,正、反两个方向的插入将产生不同大小的 DNA 片段,通过凝胶电泳即可鉴定插入片段方向是否正确.