中国药典微生物限度检查法的检验量和供试液制备

稀释液配制后，应采用验证合格的灭菌程序灭菌。1 .pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液照无菌检查法（附录XII A）制备。2.pH6.8无菌磷酸盐缓冲液、pH7.6无菌磷酸盐缓冲液按缓冲液（二部附录XV D）配制后，过滤，分装，灭菌。如需要，可在上述稀释液灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。3.0.9%无菌氯化钠溶液取氯化钠9.0g，加水溶解使成1000ml，过滤，分装，灭菌。 培养基可按以下处方制备，也可使用按该处方生产的符合要求的脱水培养基。配制后，应采用验证合格的灭菌程序灭菌。1.营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基及改良马丁琼脂培养基照无菌检查法（附录XII A）制备。2.玫瑰红钠琼脂培养基胨 5.0g玫瑰红钠 0.0133g葡萄糖 10.0g琼脂 14.0g磷酸二氢钾 1.0g水 1000ml硫酸镁 0.5g除葡萄糖、玫瑰红钠外，取上述成分，混合，微温溶解，滤过，加入葡萄糖、玫瑰红钠，分装．灭菌。3.酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（YPD )胨 10.0g琼脂 14.0g酵母浸出粉 5.0g水 1000ml葡萄糖 20.0g除葡萄糖外，取上述成分．混合，微温溶解，滤过，加人葡萄糖，分装．灭菌。4．胆盐乳糖培养基(BL )　　胨20.0g磷酸二氢钾 1.3g乳糖 5.0g牛胆盐 2.0g氯化钠 5.0g（或去氧胆酸钠） ( 0.5g)磷酸氢二钾 4.0g水 1000ml除乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH值使灭菌后为7.4 ±0.2，煮沸，滤清，加人乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠，分装，灭菌。5.乳糖胆盐发酵培养基胨 20.0g0.04%溴甲酚紫指示液 25ml乳糖 10.0g水 l000ml牛胆盐 5.0g除0.04%溴甲酚紫指示液外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH值使灭菌后为7.4 ±0.2，加人0.04%溴甲酚紫指示液，根据要求的用量分装于含倒管的试管中。灭菌。所用倒管的规格应保证产气结果的观察。6．曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB )营养琼脂培养基 100ml曙红钠指示液 2ml20%乳糖溶液 5ml亚甲蓝指示液 1.3～1.6ml取营养琼脂培养基，加热溶化后，冷至60℃，按无菌操作加入灭菌的其他3种溶液，摇匀，倾注平皿。7.麦康凯琼脂培养基（MacC）　　胨20.0g1%中性红指示液 3ml乳糖 10.0g琼脂 14.0g牛胆盐 5.0g水 l000ml氯化钠 5.0g除乳糖、1%中性红指示液、牛胆盐及琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH值使灭菌后为7.2 ±0.2，加入琼脂，加热溶化后，再加入其余各成分，摇匀，分装，灭菌，冷至约60℃，倾注平皿。8.4 -甲基伞形酮葡糖昔酸（4-methylumbelliferyl-β-D-glucuionide，MUG）培养基胨 10.0g磷酸二氢钾（无水） 0.9g硫酸锰 0.5mg磷酸氢二钠（无水） 6.2g硫酸锌 0.5mg亚硫酸钠 40mg硫酸镁 0.1g去氧胆酸钠 1.0g氯化钠 5.0gMUG 75mg氯化钙 50mg水 l000ml除MUG外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，加人MUG，溶解，每管分装5ml，灭菌。9.三糖铁琼脂培养基（TSI )胨 20.0g牛肉浸出粉 5.0g乳糖 10.0g蔗糖 10.0g葡萄糖 1.0g氯化钠 5.0g硫酸亚铁 0.2g硫代硫酸钠 0.2g0.2%酚磺酞指示液 12.5ml琼脂 12.0g水 1000ml除三种糖、0.2%酚磺酞指示液、琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH值使灭菌后为7.3±0.1,加入琼脂，加热溶化后，再加入其余各成分，摇匀，分装，灭菌，制成高底层（2～75px）短斜面。10．四硫磺酸钠亮绿培养基（TTB）胨 5.0g硫代硫酸钠 30.0g牛胆盐 1.0g水 l000ml碳酸钙 10.0g取上述成分，混合，微温溶解，灭菌。临用前，取上述培养基，每10ml加入碘试液0.2ml和亮绿试液0.lml，混匀。11.沙门、志贺菌属琼脂培养基（SS）胨 5.0g硫代硫酸钠 8.5g牛肉浸出粉 5.0g中性红指示液 2.5ml乳糖 10.0g亮绿试液 0.33ml牛胆盐 8.5g琼脂 16.0g枸橼酸钠 8.5g水 1000ml枸橼酸铁铵 1.0g除乳糖、中性红指示液、琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH值使灭菌后为7.2±0.1,滤过，加入琼脂，加热溶化后，再加入其余各成分，摇匀，灭菌，冷至60℃，倾注平皿。12．胆盐硫乳琼脂培养基（DHL )胨 20.0g枸橼酸钠 1.0g牛肉浸出粉 3.0g枸橼酸铁铵 1.0g乳糖 10.0g中性红指示液 3ml蔗糖 10.0g琼脂 16.0g去氧胆酸钠 1.0g水 l000ml硫代硫酸钠 2.3g除糖、指示液及琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH值使灭菌后为7.2±0.1,加入琼脂，加热溶化后，再加人其余成分，摇匀，冷至60 ℃，倾注平皿。13.溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基胨 10.0g溴化十六烷基三甲铵 0.3g牛肉浸出粉 3.0g琼脂 14.0g氯化钠 5.0g水 l000ml除琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH值使灭菌后为7.5±0.1，加入琼脂，加热溶化后，分装，灭菌，冷至60 ℃，倾注平皿。14．亚碲酸盐肉汤培养基临用前，取灭菌的营养肉汤培养基，每100ml中加人新配制的1%亚谛酸钠（钾）试液0.2ml，混匀，即得。15．卵黄氯化钠琼脂培养基胨 6.0g10%氯化钠卵黄液 100ml牛肉浸出粉 1.8g琼脂 14.0g氯化钠 30.0g水 650ml除10 %氯化钠卵黄液外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH值使灭菌后为7.6土0 .1，灭菌，待冷至约60 ℃，以无菌操作加入10%氯化钠卵黄液，充分振摇，倾注平皿。10%氯化钠卵黄液的制备取新鲜鸡蛋1个，以无菌操作取出卵黄，放入10%无菌氯化钠溶液100ml中，充分振摇，即得。16.甘露醇氯化钠琼脂培养基胨 10.0g酚磺酞指示液 2.5ml牛肉浸出粉 1.0g琼脂 14.0g甘露醇 10.0g水 l000ml氯化钠 75.0g除甘露醇、酚磺酞指示液及琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节州值使灭菌后为7.4 ±0.2，加入琼脂，加热溶化后，滤过，分装，灭菌，冷至60 ℃，倾注平皿。17．乳糖发酵培养基胨 20.0g乳糖 10.0g0.04%溴甲酚紫指示液 25ml水 l000ml除0.04%溴甲酚紫指示液外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，加入指示液，分装于含倒管的小试管中，每管3ml．灭菌。18．绿脓菌素（Pyocyanin）测定用培养基（PDP琼脂培养基）胨 20.0g甘油 l0ml氯化镁（无水） 1.4g琼脂 14.0g硫酸钾（无水） 10.0g水 1000ml取胨、氯化镁、硫酸钾和水混合，微温溶解，调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，加入甘油及琼脂，加热溶化，混匀，分装于试管，灭菌，置成斜面。19.梭菌增菌培养基牛肉浸出粉 10.0g盐酸半胱氨酸 0.5g胨 10.0g氯化钠 5.0g酵母浸出粉 3.0g醋酸钠 3.0g可溶性淀粉 1.0g琼脂 0.5g葡萄糖 5.0g水 1000ml取上述成分，混合，加热煮沸使溶解，调节pH值使灭菌后为6.8士0.2，加热溶化，滤过，分装，灭菌。20.哥伦比亚琼脂培养基酪蛋白胰酶消化物 10.0g肉胃酶消化物 5.0g心胰酶消化物 3.0g酵母浸出粉 5.0g玉米淀粉 1.0g氯化钠 5.0g琼脂 15.0g水 1000ml除琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH值使灭菌后为7.3士0.2，加入琼脂，加热溶化，滤过，分装，灭菌，冷至45～50 ℃，加人相当于20mg庆大霉素的无菌硫酸庆大霉素，混匀，倾注平皿。21．沙氏葡萄糖液体培养基胨 10g葡萄糖 40g水 1000ml除葡萄糖外，取上述成分，混合，微温溶解，滤过。加人葡萄糖，溶解，分装，灭菌。22．沙氏葡萄糖琼脂培养基胨 10g水 1000ml葡萄糖 40g琼脂 14g除琼脂和葡萄糖外，混合，微温溶解，滤过。加入琼脂和葡萄糖，溶解，分装，灭菌。23.（科玛嘉）念珠菌显色培养基（注1）胨 10.2g琼脂 15g氢罂素 0.5g灭菌水 1000ml色素 22.0g除琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH值至6.3士0.2。滤过，加入琼脂，加热煮沸，不断搅拌至琼脂完全溶解，倾注平皿。24.1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基黄色玉米粉 40g琼脂 10～15g聚山梨酯80 10ml水 1000ml取玉米粉、聚山梨酯80及蒸馏水500ml，混合，65℃加热30分钟，混匀，用纱布滤过，补足原水量。取琼脂，水500ml，混合，加热溶解。将以上两种溶液混合，摇匀，分装，灭菌。

非无菌药品的微生物限度标准是基于药品的给药途径及对患者健康潜在的危害而制订的。药品的生产、贮存、销售过程中的检验，原料及辅料的检验，新药标准制订，进口药品标准复核，考察药品质量及仲裁等，除另有规定外，其微生物限度均以本标准为依据。 细菌数每1g不得过l000cfu。每lml不得过100cfu。霉菌和酵母菌数每lg或lml不得过100cfu。大肠埃希菌每1g或lml不得检出. 3.1用于手术、烧伤及严重创伤的局部给药制剂应符合无菌检查法规定。3.2耳、鼻及呼吸道吸入给药制剂细菌数每1g、lml或l0cm²，不得过100cfu。霉菌和酵母菌数每1g、lml或l0cm²，不得过10cfu。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌每1g、lml或l0cm²不得检出。大肠埃希菌鼻及呼吸道给药的制剂，每1g、lml或l0cm²，不得检出。3.3阴道、尿道给药制剂细菌数每1g、lml或l0cm²，不得过100cfu。霉菌数和酵母菌数每1g、lml或l0cm²应小于10cfu。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌每1g、lml或l0cm²，不得检出。3 .4直肠给药制剂细菌数每1g不得过l000cfu。每lml不得过100cfu。霉菌和酵母菌数每1g或lml不得过100cfu。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌每lg或lml不得检出。3.5其他局部给药制剂细菌数每1g、lml或l0cm²不得过100cfu。霉菌和酵母菌数每1g、lml或l0cm²不得过100cfu。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌每1g、lml或l0cm²不得检出。 参照相应制剂的微生物限度标准执行。注1：本检查法中白色念珠菌检查所描述该菌在念珠菌显色培养基上的菌落特征，是指该菌在法国科玛嘉公司提供的科玛嘉念珠菌显色培养基上生长的菌落特征。给出这一信息是为了方便本方法的使用者，并不表示对该公司产品的认可．若其他等效产品具有相同的效果，那么也可使用其他等效的产品。 以上文中方法中提到的“无菌检查法（附录XII A）”为《中国药典》2010版二部附录XII A无菌检查法。

检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml或cm²）。
除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；膜剂为100cm²；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml（其中10g或10ml用于阳性对照试验）。
检验时,应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂还不得少于4片。
一般应随机抽取不少于检验用星（两个以上最小包装单位）的3倍最供试品。 根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45℃。供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。
除另有规定外，常用的供试液制备方法如下。
1.液体供试品
取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为l:10的供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。
2.固体、半固体或黏稠性供试品
取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1:10的供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。
3.需用特殊方法制备供试液的供试品
（1）非水溶性供试品
方法1 取供试品5g（或5ml )，加至含溶化的（温度不超过45℃）5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加人45 ℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1 : 20的供试液。
方法2 取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯（制法见附录XII A无菌检查法中供试品的无菌检查项下）和无菌玻璃珠的适宜容器中．必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。然后加入45 ℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，振摇5～10分钟，萃取，静置使油水明显分层，取其水层作为l : 10的供试液。
（2）膜剂供试品
取供试品100cm²，剪碎，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml（必要时可增加稀释液），浸泡，振摇，作为1:10的供试液。
（3）肠溶及结肠溶制剂供试品
取供试品10g，加pH6.8无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制剂）或pH7.6无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂）至100ml，置45 ℃水浴中，振摇，使溶解，作为1 :10的供试液。
（4）气雾剂、喷雾剂供试品
取规定量供试品，置冰冻室冷冻约1小时，取出，迅速消毒供试品开启部位，用无菌钢锥在该部位钻一小孔，放至室温，并轻轻转动容器，使抛射剂缓缓全部释出。用无菌注射器吸出全部药液，加至适量的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（若含非水溶性成分，加适觉的无菌聚山梨酯80）中，混匀，取相当于10g或10ml的供试品，再稀释成1:10的供试液。
（5）贴剂供试品
取规定量供试品，去掉贴剂的保护层，放置在无菌玻璃或塑料片上，粘贴面朝上。用适宜的无菌多孔材料（如无菌纱布）覆盖贴剂的粘贴面，以避免贴剂粘贴在一起。然后将其置于适宜体积并含有表面活性剂（如聚山梨酯80或卵磷脂）的稀释剂中，用力振荡至少30分钟，制成供试液。贴剂也可采用其他适宜的方法制备成供试液。
（6）具抑菌活性的供试品
当供试品有抑菌活性时，采用下列方法进行处理，以消除供试液的抑菌活性，再依法检查。常用的方法如下。
①培养基稀释法取规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少，至不含抑菌作用。测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数时，取同稀释级的供试液2ml，每1ml供试液可等量分注多个平皿，倾注琼脂培养基，混匀，凝固，培养，计数。每1ml供试液所注的平皿中生长的菌落数之和即为1ml的菌落数，计算每1ml供试液的平均菌落数，按平皿法计数规则报告菌数；控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。
②离心沉淀法取一定量的供试液，500转/分钟离心3分钟，取全部上清液混合。用于细菌检查。
③薄膜过滤法见细菌、霉菌及酵母菌计数项下的“薄膜过滤法”。
④中和法凡含汞、砷或防腐剂等具有抑菌作用的供试品，可用适宜的中和剂或灭活剂消除其抑菌成分。中和剂或灭活剂可加在所用的稀释液或培养基中。