PCR电泳条带不亮，有的非特异扩增，怎么改善条件，退火温度58，30秒。条带如图
在模板变性后温度快速冷却至40℃～60℃(某个退火温度)的时候，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞，这就使PCR后期的过程成为可能。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。
另一种说法：熔解温度（Tm）是引物的一个重要参数。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火， 同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃。
设定Tm有几种公式。有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。 有的是根据GC含量估算Tm。确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。
Tm值除了用软件之外，还可以这个公式：2（A+T）+4（C+G），然后减5—10度
根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。
为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃
或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
另外，由于PCR仪的不同，注意其退火温度的设定：一般的PCR仪允许设置跨度12-15度的梯度范围，所以你的梯度范围尽可能设置宽一点，争取一轮梯度就可以确定最佳可用退火温度。
具体从多少度到多少度，要看你这对引物的Tm值，如果两个引物Tm值不高，可以设置48-60的梯度；否则可以设置58-70度的梯度；如果两个引物的Tm中等，则可以设置53-65的梯度范围，具体情况灵活掌握。
传统梯度PCR仪中是可以放置12个样品进行梯度的，需要注意的是每个相邻两孔间的温度差异是不等的，尤其是第2、3孔与第1孔接近，第10、11孔与第12孔接近。可以舍弃第2、2、10、11孔，只在第1、4、5、6、7、8、9、12孔中放置共8个样品，孔间温度变化几乎呈真正的梯度状。
55度的时候有没有primer dimer？温度低的时候PCR的特异性会降低，如果看到更多的primer dimer，说明可能55度的时候primer dimer的扩增更加有效率，跟你的DNA template的扩增竞争
1、方法一：可以将你目标条带进行胶回收之后的产物作为模板，采用原条件进行扩增，看条带是否可以。二次扩增的时候使用高保真的酶进行扩增。2、方法二：升高温度，减少非特异性
3、方法三：试试降落PCR
4、方法四：重新设计一对引物
望采纳，谢谢
你指的是哪一个泳道的DNA，第四泳道还是第七泳道？marker是DL2000吗？
答：物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出 现假阴性;退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影 响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率.有时还有必要用标准的温度计,检测一下 扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度,这也是PCR失败的原因之一.靶...
答：1、方法一：可以将你目标条带进行胶回收之后的产物作为模板，采用原条件进行扩增，看条带是否可以。二次扩增的时候使用高保真的酶进行扩增。2、方法二：升高温度，减少非特异性 3、方法三：试试降落PCR 4、方法四：重新设计一对引物 望采纳，谢谢 ...
答：1、出现非特异扩增可能是你的引物设计上特异性差或者引物浓度过高，Mg浓度或酶含量过高（适当改变Mg浓度从1mM到3mM，间隔0.5mM进行梯度试验，或者酶含量改变按0.5U为间隔梯度试验。）2、如果出现拖尾，，要考虑引物特异性和模板纯度，另外循环数、退火温度以及Mg含量过高、dNTP过多等也可能造成拖尾。
答：1.PCR一个亮一个不亮,如果每次都这样,那说明模板量少,或是目标条带短（条带短自然结合EB少）.其他像扩增效率,试剂污染等因素概率比较少.2,没产物：一来引物有没有问题,二,模板有没有问题,三,你的PCR条件是否合适你的引物.
答：“PCR”技术的非特异性扩增：指进行PCR扩增出来的条带不是所需要的，且引物与模板在非目的条带处有错配，导致延伸产物不是目的条带。非特异性扩增在琼脂糖电泳时可以看到在目的条带外出现了其他条带。引起非特异性扩增的原因有：镁离子浓度过高、退火温度太低和引物的特异性不好等。
答：主带显著的情况下，很可能是引物聚合体。如果没有出现显著的你想要的主带，则是非特异扩增产物。第一种情况没事不用理会，第二种情况需要筛查模版中与引物的非特异性互补区，重新设计引物，或者升高退火温度试试。
答：如果点样没有误差的话，那应该是PCR仪的问题了，半导体PCR仪用的时候长了，中间和四周温度有误差，温度控制不准，这个产物自然就不同了。可以让厂家给测试一下。或者换一下散热模块之类的。特别是国产的PCR仪，寿命就那么长。
答：非特异性扩增太多，建议稀释模板。提高退火温度，再试试。还有如果一次PCR产物也是如此，建议切胶回收与目的条带相近处的弥散带作为二次的模板。
答：首先看你的MARK亮不亮，如果MARK不亮的话说明EB少了，多加点EB。如果MARK亮的话，那就是你的PCR产物浓度不够，这个就原因多了 1、增加引物浓度 2、增加PCR循环数 3、降低PCR退火温度以提高扩增效率 4、DNA模板不纯，重新制备DNA模板，建议购买商品化提取试剂盒 5、增加上样量，这个意义不太大，10ul...
答：其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。5、出现片状拖带或涂抹带 PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其...
