单细胞测序扫盲：是什么？为什么？怎么做？
kuaidi.ping-jia.net 作者：佚名 更新日期：2024-07-23
一、什么是单细胞测序？
如果简单地说，单细胞测序就是获取单个细胞遗传信息的测序技术，似乎没有多大的帮助。为了理解这个问题，咱们不妨先来了解一下测序技术到底可以做些什么。
目前，测序可以回答以下6类问题：
1. DNA的序列：ATCG怎么排列，以及各序列的丰度；
2. DNA的表观遗传修饰：比如甲基化、羟甲基化，以及组蛋白的各种修饰；
3. RNA的序列：AUCG怎么排列，以及各序列的丰度；
4. RNA的表观遗传修饰：比如近年很火的m6A修饰；
5. 染色质的结构：3C、4C、5C等各种C；
6. 其他魔性应用：比如DNA损伤位置、蛋白-蛋白相互作用等。
单细胞测序，就是想办法在单细胞层面去回答以上6类问题。
二、为什么要使用单细胞测序？
如果把这个问题换个姿势来问，那就变成，为什么非用单细胞测序不可？
世界上没有两片相同的叶子。对于多细胞生物来说，细胞与细胞之间是有差异的。当然了，这个差异可大可小。
比如说，受精卵从一个细胞开始分裂，并逐渐形成囊胚，最终发育成个体的时候，细胞与细胞之间的差异会越来越大：有的分化成神经元，有的分化成骨骼肌，各自表达着不同的遗传信息，承担着不同的生理功能。
又比如在肿瘤组织中，肿块中心的细胞，肿块周围的细胞，淋巴转移灶的细胞，以及远端转移的细胞，其基因组和转录组等遗传信息，是存在差异的。而这种差异，在临床上，可以决定该肿瘤对某种疗法是否有效。
这就是所谓的 遗传信息的异质性 。
传统的研究方法，是在多细胞水平进行的。因此，最终得到的信号值，其实是多个细胞的平均，丢失了异质性的信息。为了让大家能够更加直观地理解这个问题，我们不妨来看下面这张图：
为了检测某个蛋白质的表达量，我们可以用Western blot和流式细胞术来实现。但是，用Western blot的话，我们并没有办法区分上述的情况：目的蛋白只在10%的细胞中强表达，还是在50%的细胞里中等表达，还是在所有细胞中弱表达呢？因为最终电泳跑出来，就是一条差不多强度的带。但如果用流式细胞术这种在单细胞水平对荧光强度加以测定的技术，就能区分上述的情况了。
同样道理，单细胞测序能够检出混杂样品测序所无法得到的异质性信息。而这将带领整个遗传学领域进入新的次元。
三、如何实现单细胞测序？
目前主要有两种策略来实现单细胞测序。
第一种，也就是目前大多数人所想象的那样，将单个细胞分离出来，并独立构建测序文库，最终进行测序的路线。我们可以通过流式细胞术（含微流体芯片），或者激光捕获显微切割（LCM：激光捕获显微切割技术）来实现。流式细胞术估计大家比较熟悉，就不多讲了，它主要运用于细胞样品。对于组织切片样品来说，主要是通过LCM来获取单细胞，原理可以见下面的示意图。
不过，将单细胞挨个分离出来再分别建库测序，通量非常低，这主要受成本的限制。随着待测单细胞的个数的增长，测序的成本也会几乎呈线性提升。通常做十几二十来个细胞，就要烧掉很多钱了。然而，这数十个细胞，就足够说明问题了吗？
为了克服这个困难，近年来多采取第二种策略：基于标签（barcode）的单细胞识别。它的主要思想是，给每个细胞加上独一无二的DNA序列，这样在测序的时候，就把携带相同barcode的序列视为来自同一个细胞了。这种策略，可以通过一次建库，测得数百上千个单细胞的信息。
不过，针对具体的测序类型，给细胞加barcode的方案是有不小的区别的。对于RNA（转录组mRNA）来说，会比较容易理解一些。由于mRNA测序前需要做逆转录，那么我们只需要在poly T引物的5’端加入barcode即可。具体可见下面的示意图（来自文献doi:10.1038/nprot.2016.154）：
首先将单细胞悬液样品和带有barcode的水凝胶珠子，通过微流体芯片，包裹在一个油滴之中。在油滴中进行逆转录之后，每一个单细胞的cDNA文库，就带上了独一无二的barcode了（蓝色部分）。最后，我们再将所有的单细胞cDNA文库混在一起测序，再通过程序识别barcode，区分单细胞。
如果测序对象是DNA，比如全基因组，就需要用别的方式来加barcode。目前主要是通过一种经过改造的高效转座酶（transposase）Tn5来实现。
基因转座是指转座子DNA从一个染色体座位“跳跃”到另外一个座位的过程。在这个过程中，有转座酶的参与。单细胞的DNA测序就利用了这个特性，将barcode DNA预先和转座酶Tn5组装好，再通过上述的微流体技术，将细胞和转座复合物包裹在一个油滴之中。随后，转座酶会把barcode插入到基因组DNA之中。这个过程在文献中也被成为tagmentation。
不过，基于Tn5的barcode复杂度（即能有多少独一无二的barcode）还是比较有限的。为了保证tagmentation的效率，上图中红色的barcode区域不可以过长。同时，为了避免测序错误带来的误识别（如偶尔测错了一个碱基，但却被当成另外一个barcode），barcode的复杂度也不是4的n次方那么高，需要引入校正机制。具体就不展开讲了。总地来说，仅靠Tn5来做单细胞，一次往往仅能识别数十到数百个单细胞。
为了提高复杂度，即一次能够捕获的单细胞数目，目前的解决方案是走组合索引（combinatorial indexing）路线。（见下图，来自文献doi:10.1038/nmeth.4154）
它的主要思路是，通过两步反应，加两次标签。首先，将单细胞悬液放在多孔板中，并用转座酶Tn5给细胞加第一个barcode，这里每个孔中的barcode是不同的。然后，再将样品混合起来，通过流式细胞术，将少量的细胞分选到含有建库PCR引物的多孔板中。而这些引物是带有第二轮barcode的。因此，经过Tn5的转座，和PCR加标签，绝大部分的细胞就能带上独一无二的barcode了。
读到这里，肯定有人发现这个方案存在的问题。举个例子，万一在流式分选时，在第一个孔里分了两个或以上橙色细胞，然后又通过PCR被加上了红色的标签，那这两个单细胞就无法被区分开来了。
确实如此，combinatorial indexing大概会有10%的撞车率（collision rate），即约有10%的机会把两个单细胞被误认为是同一个。这个数值的高低，取决于第一步tagmentation的复杂度（复杂度越高，撞车率越低），以及在分选时，分到每一个孔里的细胞数量（数量越低，撞车率越低）。但是，combinatorial indexing却能一次识别数千个单细胞，将通量提升数十至上百倍。鱼与熊掌，就看实验者的取舍了。
转自《 单细胞测序扫盲：是什么？为什么？怎么做？ - 知乎 (zhihu.com) 》
单细胞测序扫盲:是什么?为什么?怎么做?
答：一、什么是单细胞测序？如果简单地说，单细胞测序就是获取单个细胞遗传信息的测序技术，似乎没有多大的帮助。为了理解这个问题，咱们不妨先来了解一下测序技术到底可以做些什么。目前，测序可以回答以下6类问题：1. DNA的序列：ATCG怎么排列，以及各序列的丰度；2. DNA的表观遗传修饰：比如甲基化、羟甲基...
如何 解读 单细胞 测序
答：单细胞测序是指DNA研究中涉及测序单细胞微生物相对简单的基因组，更大更复杂的人类细胞基因组。简介编辑 细胞是生物学的基本单位，研究人员正更加努力地尝试将它们进行单个分离、研究和比较。更大更复杂的人类细胞基因组。随着测序成本的大幅度下降，破译来自单细胞的30亿碱基的基因组并逐个细胞比较序列正在...
为什么要给单个细胞测序
答：简单来说，细胞在每一次分裂过程中，DNA的自我复制都会产生错误。这个错误就是所谓的细胞突变。这样造成在机体内很多细胞都多多少少有点不一样。如果这些细胞突变刚好发生在一些重要的基因上的话，就有可能变成癌细胞。绝大部分的肿瘤，癌症就是由这些细胞突变造成的。从这个意义上来说，单细胞测序几乎是...
单细胞测序应用及思路解析
答：单细胞测序（Single-cell sequencing）是一种高通量、高分辨率的分子生物学技术，可以对单个细胞进行基因组、转录组、表观组等方面的测序，从而深入地了解单个细胞的特性。单细胞测序技术已经在生物医学、生态学、农业等领域得到广泛应用。下面将介绍单细胞测序的应用及思路解析。一、应用 疾病研究：单细胞测...
单细胞测序算大分子研究吗
答：单细胞测序就是指获得单独细胞遗传物质的测序技术，是指对单独细胞水平上，对基因或转录组开展获取增加和高通量测序测序剖析。该技术可以揭露但个细胞特有的基因结构和基因的表达情况，包含结构变异、拷贝数基因变异、RNA表述水准等相关信息，使不一样细胞种类得到精准区别，并有利于专家在但细胞水准开展分子...
前沿技术| 单细胞测序技术小讲
答：一、单细胞测序技术为什么如此火热 细胞是生物体和生物过程的运作基础，在类型、行为和状态上有着广泛的差异（即细胞异质性）。传统的基因测序方法（Bulk RNA-seq）是对组织进行的检测，得到的结果是所有细胞的平均值，会忽略细胞之间的差异性，比如有的细胞转录水平比较高，有的细胞则...
单细胞测序简介
答：单细胞测序，这一DNA研究前沿技术，专攻于对单细胞微生物的基因组进行相对简单的测序，而人类细胞基因组则更为庞大复杂。随着测序成本的大幅降低，科学家们得以实际操作，对单个细胞中的30亿碱基进行基因组测序并进行细胞间序列的精确对比，这一技术逐渐从理论走向现实。[1]在实际应用中，单细胞测序最显著...
一文看懂植物单细胞测序怎么做?
答：单细胞RNA测序(scRNA-seq)提供了高分辨率分析基因表达和构建复杂器官或生物体发育图谱的机会。最近,10x Genomics scRNA-seq平台已被广泛用于鉴定拟南芥根中的细胞类型或结构域标记(Rich Griffinetal.,2020),但该技术在茎组织中的应用还受到限制。单细胞测序的数据可以结合CHIP-seq的对转录因子的鉴定或者survey对染色体状...
为什么要给单个细胞测序?
答：3. 有实验证据表明，一些癌症组织中各个癌细胞由于未知的原因发生了严重的染色体变异而且癌细胞之间变异方式完全不同，所以对癌细胞的单细胞基因组测序有助于我们了解一些癌症发生的机制。4. 实验证据表明，当机体受到外源DNA入侵如病毒和转座子时，并不是所有细胞基因组同时受到影响，单细胞基因组测序有助...
生命科学单细胞测序(10×genomics技术)的原理是什么?
答：1.单细胞测序与普通转录组测序的区别 普通转录组使用细胞混合物组成的样品进行测序，因此只能估计基因在细胞群中的平均表达水平，没有考虑样本中各个细胞的基因表达的异质性。无法分析早期发育组织或复杂组织的异质系统（如大脑组织等）。为克服这一限制，开发了单细胞水平的转录组测序技术（scRNA-seq）。2....
如果简单地说，单细胞测序就是获取单个细胞遗传信息的测序技术，似乎没有多大的帮助。为了理解这个问题，咱们不妨先来了解一下测序技术到底可以做些什么。
目前，测序可以回答以下6类问题：
1. DNA的序列：ATCG怎么排列，以及各序列的丰度；
2. DNA的表观遗传修饰：比如甲基化、羟甲基化，以及组蛋白的各种修饰；
3. RNA的序列：AUCG怎么排列，以及各序列的丰度；
4. RNA的表观遗传修饰：比如近年很火的m6A修饰；
5. 染色质的结构：3C、4C、5C等各种C；
6. 其他魔性应用：比如DNA损伤位置、蛋白-蛋白相互作用等。
单细胞测序，就是想办法在单细胞层面去回答以上6类问题。
二、为什么要使用单细胞测序？
如果把这个问题换个姿势来问，那就变成，为什么非用单细胞测序不可？
世界上没有两片相同的叶子。对于多细胞生物来说，细胞与细胞之间是有差异的。当然了，这个差异可大可小。
比如说，受精卵从一个细胞开始分裂，并逐渐形成囊胚，最终发育成个体的时候，细胞与细胞之间的差异会越来越大：有的分化成神经元，有的分化成骨骼肌，各自表达着不同的遗传信息，承担着不同的生理功能。
又比如在肿瘤组织中，肿块中心的细胞，肿块周围的细胞，淋巴转移灶的细胞，以及远端转移的细胞，其基因组和转录组等遗传信息，是存在差异的。而这种差异，在临床上，可以决定该肿瘤对某种疗法是否有效。
这就是所谓的 遗传信息的异质性 。
传统的研究方法，是在多细胞水平进行的。因此，最终得到的信号值，其实是多个细胞的平均，丢失了异质性的信息。为了让大家能够更加直观地理解这个问题，我们不妨来看下面这张图：
为了检测某个蛋白质的表达量，我们可以用Western blot和流式细胞术来实现。但是，用Western blot的话，我们并没有办法区分上述的情况：目的蛋白只在10%的细胞中强表达，还是在50%的细胞里中等表达，还是在所有细胞中弱表达呢？因为最终电泳跑出来，就是一条差不多强度的带。但如果用流式细胞术这种在单细胞水平对荧光强度加以测定的技术，就能区分上述的情况了。
同样道理，单细胞测序能够检出混杂样品测序所无法得到的异质性信息。而这将带领整个遗传学领域进入新的次元。
三、如何实现单细胞测序？
目前主要有两种策略来实现单细胞测序。
第一种，也就是目前大多数人所想象的那样，将单个细胞分离出来，并独立构建测序文库，最终进行测序的路线。我们可以通过流式细胞术（含微流体芯片），或者激光捕获显微切割（LCM：激光捕获显微切割技术）来实现。流式细胞术估计大家比较熟悉，就不多讲了，它主要运用于细胞样品。对于组织切片样品来说，主要是通过LCM来获取单细胞，原理可以见下面的示意图。
不过，将单细胞挨个分离出来再分别建库测序，通量非常低，这主要受成本的限制。随着待测单细胞的个数的增长，测序的成本也会几乎呈线性提升。通常做十几二十来个细胞，就要烧掉很多钱了。然而，这数十个细胞，就足够说明问题了吗？
为了克服这个困难，近年来多采取第二种策略：基于标签（barcode）的单细胞识别。它的主要思想是，给每个细胞加上独一无二的DNA序列，这样在测序的时候，就把携带相同barcode的序列视为来自同一个细胞了。这种策略，可以通过一次建库，测得数百上千个单细胞的信息。
不过，针对具体的测序类型，给细胞加barcode的方案是有不小的区别的。对于RNA（转录组mRNA）来说，会比较容易理解一些。由于mRNA测序前需要做逆转录，那么我们只需要在poly T引物的5’端加入barcode即可。具体可见下面的示意图（来自文献doi:10.1038/nprot.2016.154）：
首先将单细胞悬液样品和带有barcode的水凝胶珠子，通过微流体芯片，包裹在一个油滴之中。在油滴中进行逆转录之后，每一个单细胞的cDNA文库，就带上了独一无二的barcode了（蓝色部分）。最后，我们再将所有的单细胞cDNA文库混在一起测序，再通过程序识别barcode，区分单细胞。
如果测序对象是DNA，比如全基因组，就需要用别的方式来加barcode。目前主要是通过一种经过改造的高效转座酶（transposase）Tn5来实现。
基因转座是指转座子DNA从一个染色体座位“跳跃”到另外一个座位的过程。在这个过程中，有转座酶的参与。单细胞的DNA测序就利用了这个特性，将barcode DNA预先和转座酶Tn5组装好，再通过上述的微流体技术，将细胞和转座复合物包裹在一个油滴之中。随后，转座酶会把barcode插入到基因组DNA之中。这个过程在文献中也被成为tagmentation。
不过，基于Tn5的barcode复杂度（即能有多少独一无二的barcode）还是比较有限的。为了保证tagmentation的效率，上图中红色的barcode区域不可以过长。同时，为了避免测序错误带来的误识别（如偶尔测错了一个碱基，但却被当成另外一个barcode），barcode的复杂度也不是4的n次方那么高，需要引入校正机制。具体就不展开讲了。总地来说，仅靠Tn5来做单细胞，一次往往仅能识别数十到数百个单细胞。
为了提高复杂度，即一次能够捕获的单细胞数目，目前的解决方案是走组合索引（combinatorial indexing）路线。（见下图，来自文献doi:10.1038/nmeth.4154）
它的主要思路是，通过两步反应，加两次标签。首先，将单细胞悬液放在多孔板中，并用转座酶Tn5给细胞加第一个barcode，这里每个孔中的barcode是不同的。然后，再将样品混合起来，通过流式细胞术，将少量的细胞分选到含有建库PCR引物的多孔板中。而这些引物是带有第二轮barcode的。因此，经过Tn5的转座，和PCR加标签，绝大部分的细胞就能带上独一无二的barcode了。
读到这里，肯定有人发现这个方案存在的问题。举个例子，万一在流式分选时，在第一个孔里分了两个或以上橙色细胞，然后又通过PCR被加上了红色的标签，那这两个单细胞就无法被区分开来了。
确实如此，combinatorial indexing大概会有10%的撞车率（collision rate），即约有10%的机会把两个单细胞被误认为是同一个。这个数值的高低，取决于第一步tagmentation的复杂度（复杂度越高，撞车率越低），以及在分选时，分到每一个孔里的细胞数量（数量越低，撞车率越低）。但是，combinatorial indexing却能一次识别数千个单细胞，将通量提升数十至上百倍。鱼与熊掌，就看实验者的取舍了。
转自《 单细胞测序扫盲：是什么？为什么？怎么做？ - 知乎 (zhihu.com) 》
答：一、什么是单细胞测序？如果简单地说，单细胞测序就是获取单个细胞遗传信息的测序技术，似乎没有多大的帮助。为了理解这个问题，咱们不妨先来了解一下测序技术到底可以做些什么。目前，测序可以回答以下6类问题：1. DNA的序列：ATCG怎么排列，以及各序列的丰度；2. DNA的表观遗传修饰：比如甲基化、羟甲基...
答：单细胞测序是指DNA研究中涉及测序单细胞微生物相对简单的基因组，更大更复杂的人类细胞基因组。简介编辑 细胞是生物学的基本单位，研究人员正更加努力地尝试将它们进行单个分离、研究和比较。更大更复杂的人类细胞基因组。随着测序成本的大幅度下降，破译来自单细胞的30亿碱基的基因组并逐个细胞比较序列正在...
答：简单来说，细胞在每一次分裂过程中，DNA的自我复制都会产生错误。这个错误就是所谓的细胞突变。这样造成在机体内很多细胞都多多少少有点不一样。如果这些细胞突变刚好发生在一些重要的基因上的话，就有可能变成癌细胞。绝大部分的肿瘤，癌症就是由这些细胞突变造成的。从这个意义上来说，单细胞测序几乎是...
答：单细胞测序（Single-cell sequencing）是一种高通量、高分辨率的分子生物学技术，可以对单个细胞进行基因组、转录组、表观组等方面的测序，从而深入地了解单个细胞的特性。单细胞测序技术已经在生物医学、生态学、农业等领域得到广泛应用。下面将介绍单细胞测序的应用及思路解析。一、应用 疾病研究：单细胞测...
答：单细胞测序就是指获得单独细胞遗传物质的测序技术，是指对单独细胞水平上，对基因或转录组开展获取增加和高通量测序测序剖析。该技术可以揭露但个细胞特有的基因结构和基因的表达情况，包含结构变异、拷贝数基因变异、RNA表述水准等相关信息，使不一样细胞种类得到精准区别，并有利于专家在但细胞水准开展分子...
答：一、单细胞测序技术为什么如此火热 细胞是生物体和生物过程的运作基础，在类型、行为和状态上有着广泛的差异（即细胞异质性）。传统的基因测序方法（Bulk RNA-seq）是对组织进行的检测，得到的结果是所有细胞的平均值，会忽略细胞之间的差异性，比如有的细胞转录水平比较高，有的细胞则...
答：单细胞测序，这一DNA研究前沿技术，专攻于对单细胞微生物的基因组进行相对简单的测序，而人类细胞基因组则更为庞大复杂。随着测序成本的大幅降低，科学家们得以实际操作，对单个细胞中的30亿碱基进行基因组测序并进行细胞间序列的精确对比，这一技术逐渐从理论走向现实。[1]在实际应用中，单细胞测序最显著...
答：单细胞RNA测序(scRNA-seq)提供了高分辨率分析基因表达和构建复杂器官或生物体发育图谱的机会。最近,10x Genomics scRNA-seq平台已被广泛用于鉴定拟南芥根中的细胞类型或结构域标记(Rich Griffinetal.,2020),但该技术在茎组织中的应用还受到限制。单细胞测序的数据可以结合CHIP-seq的对转录因子的鉴定或者survey对染色体状...
答：3. 有实验证据表明，一些癌症组织中各个癌细胞由于未知的原因发生了严重的染色体变异而且癌细胞之间变异方式完全不同，所以对癌细胞的单细胞基因组测序有助于我们了解一些癌症发生的机制。4. 实验证据表明，当机体受到外源DNA入侵如病毒和转座子时，并不是所有细胞基因组同时受到影响，单细胞基因组测序有助...
答：1.单细胞测序与普通转录组测序的区别 普通转录组使用细胞混合物组成的样品进行测序，因此只能估计基因在细胞群中的平均表达水平，没有考虑样本中各个细胞的基因表达的异质性。无法分析早期发育组织或复杂组织的异质系统（如大脑组织等）。为克服这一限制，开发了单细胞水平的转录组测序技术（scRNA-seq）。2....
