植物组培外植体褐变与消毒剂
文章标题：论植物组织培养褐变产生的因素及对策
摘要:本文针对植物组织培养中常见的褐变现象,详细地分析了其产生的机理及影响因素,并提出了相应的对策,为科研和生产提供了一定的理论和实践依据。
关键词:植物组织培养，褐变，对策
目前，在许多植物组织培养过程中，常遇到褐变问题。褐变主
要发生在外植体，在植物愈伤组织的继代、悬浮细胞培养以及原生质体的分离与培养中也经常发生。褐变产物不仅使外植体、细胞、培养基等变褐，而且对许多酶有抑制作用，从而影响培养材料的生长与分化，严重时甚至导致死亡。本文探讨植物组织培养中褐变现象的影响因素、机理及防范措施，对我们进行科学研究或工厂生产，包括植物组织的培养,原生质体、悬浮细胞和植物器官的培养都有着十分重要的现实意义。
1褐变产生的影响因素
影响植物组织培养褐变的因子是复杂的，因植物的种类、基因型、外植体部位及生理状态等不同，褐变的程度也有所不同。
1.1植物种类及基因型不同的植物和不同的基因型决定了不同的褐化程度。在组织培养中，品种褐化难易可能是与该品种中多酚类物质含量的多少及多酚氧化酶(PPO)活性的差异有关。
1.2外植体部位及生理状态外植体的部位及生理状态不同其褐化程度不同，同时，不同时期和不同年龄的外植体在培养中褐变的程度也不同。
1.3培养基成分培养基成分中的无机盐、蔗糖浓度、激素水平等对褐变的程度的影响尤为重要。另外，其pH值也与褐变程度有较大关系。
1.4培养条件温度过高或光照过强，均可加速被培养组织的褐变。不利环境条件都能造成细胞的程序化死亡，温度是诱导程序化死亡的主要因素[1]。
2褐变产生的机理
2.1非酶促褐变
非酶促褐变是由于细胞受胁迫或其他不利条件影响所造成的细胞程序化死亡或自然发生的细胞死亡，即坏死形成的褐变现象，并不涉及酚类物质的产生。徐振彪等[1]将生长正常的愈伤组织转移到含NaCl的培养基中，组织周围尤其是接触培养基部分发生褐变，但培养基中没有看到扩散的褐化物质。当温度升高时继代保存时间过长，也会发生此类现象。但这种褐变若采取适当措施或者愈伤组织适应了胁迫环境就不再发生了[3]。
2.2酶促褐变
目前认为植物组织培养中的褐变主要是由酶促褐变引起的，培养材料变褐主要是由伤口处分泌的酚类化合物引起的[4]。酶促褐变如同一般的酶促反应，其发生必须具备三个条件，即酶、底物和氧。引起褐变的酶有多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶等。从初次培养和继代培养过程中试管苗的褐变程度和PPO的活性来看，表明PPO活性的高低是引起培养材料褐变的关键。引起褐变的酶的底物主要是酚类化合物，按其组成可分成3类:苯基羧酸（包括邻羟基苯酚、儿茶酚、没食子酸、莽草酸等），苯丙烷衍生物（包括绿原酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、单宁、木质素等），第三类是黄烷衍生物（包括花青素、黄酮、芸香苷等），但并非所有的酚类物质都是PPO的底物。
在正常发育的植物组织中,底物、氧气、PPO同时存在并不发生褐变，是因为在正常的组织细胞内由于多酚类物质分布在细胞的液泡内，而PPO则分布在各种质体或细胞质中，这种区域性分布使底物与PPO不能接触。而当细胞膜的结构发生变化和破坏时，则为酶创造了与PPO接触的条件，在氧存在的情况下使酚类物质氧化成醌，进行一系列的脱水、聚合反应，最后形成黑褐色物质，从而引起褐变。
3防止外植体产生褐变的对策
从理论上讲,酶促褐变可以通过以下三种方法加以抑制:一是除去引起氧化的物质——氧；二是捕捉或减少聚合反应的中间产物；三是抑制有关的酶。实际操作上，下列措施是被认为行之有效的。
3.1适当外植体的选择
取材时应注意选择褐变程度较小的品种和部位作外植体。成年植株比幼苗褐变程度厉害，夏季材料比冬季及早春和秋季材料的褐变要严重。冬季的芽不易生长，宜选用早春和秋季的材料作为外植体。王异星[5]用荔枝无菌苗不同组织的诱导试验表明，茎最容易诱导出愈伤组织，培养2周后长出浅黄色的愈伤组织；叶大部分不能产生愈伤组织或诱导出的愈伤组织中度褐变；而根极大部分不产生愈伤组织，诱导出的愈伤组织全部褐变。
3.2对外植体的处理
通过对较易褐变的外植体材料的预处理能减轻醌类物质的毒害作用。处理方法如下：外植体经流水冲洗后，在2-5℃的低温下处理12-24小时，再用升汞或70酒精消毒，然后接种于只含有蔗糖的琼脂培养基中培养5-7天，使组织中的酚类物质部分渗入培养基中。取出外植体用0.1漂白粉溶液浸泡10分钟，再接种到合适的培养基中。若仍有酚类物质渗出，3-5天后再转移培养基2-3次，当外植体的切口愈合后，酚类物质减少，这样可使外植体褐变减轻或完全被抑制。何琼英等[6]用抗坏血酸预处理香蕉吸芽外植体，能减轻外植体褐变，从而提高芽丛诱导率。
3.3适宜的培养基
培养基的成分与褐变程度有关，要考虑所选培养基的状
态和类型。
3.3.1适当的无机盐浓度张妙霞等[7]在柿树组织培养防止褐变所进行的试验中，4种培养基的无机盐以改良MS(大量元素减半)和1/2MS的效果最好，MS的效果较差，结果证明低浓度的无机盐可促进外植体的生长与分化，减轻外植体褐变的程度。徐振彪[1]在对玉米幼胚耐NaCl愈伤组织的筛选表明，随NaCl浓度升高，褐变现象加重。
3.3.2适当和适量的激素王异星[5]在荔枝的组织培养过程中，培养基中添加1mg/LBA 0.5mg/L2,4-D时，愈伤组织较坚硬，增殖缓慢，易产生褐变。培养基中添加1mg/LBA 1mg/L2,4-D时，愈伤组织浅黄疏松，增殖也快。
3.3.3培养基的硬度在一定范围内，琼脂用量大，培养基硬度大，褐变率低[8]，这可能是培养基的硬度影响了酚类物质的扩散速度的缘故。
3.3.4培养基中水的硬度的影响硬度低的蒸馏水褐变率低,而使用硬度较高的自来水,褐变严重,甚至会出现褐变死亡[8]。这可能是配制培养基的水改变了培养基中无机盐的浓度,间接地影响了植物外植体的褐变。
3.3.5培养基的pH值在水稻体细胞培养中，pH值为4.5-5.0时MS液体培养基可保持愈伤组织处于良好的生长状态，其表面呈黄白色，而pH值为5.5-6.0时，愈伤组织严重褐变[9]。一般来说，酸性环境(pH值为4.5-5.0)不利于褐变过程的发生[10]。
3.3.6培养条件如温度过高或光照过强，光照会提高PPO的活性，促进多酚类物质的氧化，从而加速被培养的组织褐变。高浓度CO2也会促进褐变，其原因是环境中的CO2向细胞内扩散，细胞内CO32-增多，CO32-与细胞膜上的CO32-结合，使有效CO32-减少，导致内膜系统瓦解，酚类物质与PPO相互接触，产生褐变[11]。因此，初期培养要在黑暗或弱光下进行。
3.4添加褐变抑制剂和吸附剂
褐变抑制剂主要包括抗氧化剂和PPO抑制剂。在培养基中加入偏二亚硫酸钠、L-半胱氨酸、抗坏血酸、柠檬酸、二硫苏糖醇等抗氧化剂都可以与氧化产物醌发生作用，使其重新还原为酚[12]。由于其作用过程均为消耗性的，在实际应用中应注意添加量，其中L-半胱氨酸和抗坏血酸均对外植体无毒副作用，在生产应用中可不受限制。在水稻细胞的培养基中，添加植酸(PA)，可防止褐变，PA分子中众多的羟基产生抗氧化作用，使生色物质的含量下降或PA与PPO分子中的Cu2 结合，从而降低了其活力。陈学森等[13]在对植酸在银杏组织培养中应用的研究中也证实了植酸具有抑制多酚氧化酶活性的作用。
常用的吸附剂有活性炭和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。活性炭是一种吸附性较强的无机吸附剂，能吸附培养基中的有害物质，包括琼脂中的杂质、培养物在培养过程中分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5-羟甲基糠醛等,从而有利于培养物的生长。粉末状的活性炭与颗粒状的活性炭相比吸附性更强，一般在培养基中加入1-4g/L的活性炭。在使用过程中应注意，尽量用最低浓度的活性炭来对抗褐变的产生，因为活性炭的吸附作用是没有选择性的，在吸附物质的同时，也会吸附培养基中的其他成分，对外植体的诱导分化会产生一定的负面影响[14]。而聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是酚类物质的专一性吸附剂，在生化制备中常用作酚类物质和细胞器的保护剂，可用于防止褐变[15]。
3.5进行细胞筛选和多次转移
在组织培养过程中，经常进行细胞筛选，可以剔除易褐变的细胞。在外植体接种1-2天后应立即转移到新鲜培养基中，能减轻酚类物质对培养物的毒害作用，降低抑制作用，使外植体尽快分生，连续转移5-6次，可基本解决外植体的褐变问题。
参考文献：
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[10]王东霞等,如何对抗植物组织中的组织褐变，中国花卉盆景,2002,12:29～30.
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植物组织培养
植物组织培养即植物无菌培养技术，是根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官、组织或细胞，如根、茎、叶、花、果实、种子、胚、胚珠、子房、花药、花粉以及贮藏器官的薄壁组织、维管束组织等，在无菌和适宜的人工培养基及光照、温度等条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整的植株。至今，世界各国在无性系繁殖、花卉育种、植株脱病毒和种质保存等方面，广泛应用组织培养技术。
（一）组织培养技求的应用
1．无性系繁殖无性系繁殖是植物组织培养应用的主流之一，用植物组织培养进行无性繁殖的优点是，用材少，速度快，不受气候、季节、基质等自然条件的影响，比传统的常规繁殖方法要快得多，人们又叫它'快速繁殖'或'微型繁殖'。其常见繁殖方式有短枝扦插、芽增殖、原球茎、器官分化和胚状体发生。其中芽增殖在盆栽花卉繁殖中应用最为普遍，如草本植物四季秋海棠、鸡冠花、万寿菊、长春花，观叶植物蟆叶秋海棠、网纹草、花叶芋、天鹅绒竹芋，木本植物三角花、比利时杜鹃、月季、八仙花等，在生产实践中，均已取得较好的经济效益。原球茎培养在大花蕙兰、蝴蝶兰、美丽兜兰、石斛、春兰等兰科植物和肾蕨、凤尾蕨、鹿角蕨等观赏蕨的规模性生产中得到广泛应用。胚状体培养，据报道目前已在30个科150种植物上观察到它们的愈伤组织可以分化出胚状体，而盆栽花卉中的花叶芋、山茶花都是成功的范例。器官分化主要是从外植体直接产生不定芽或不定根，一般不通过从愈伤组织进行器官分化形成植株，因为其性状有可能发生变化或经过多次继代培养后，会丧失再生植株的能力。
2．花卉育种当今盆栽花卉育种中，也广泛应用组培技术。
胚培养：在花卉种间杂交或远缘杂交中，有时虽然能正常受精，但胚往往发育不完全或胚与胚乳间不亲和，不能得到种子，可采用胚的早期离体培养促使胚正常发育，培养出杂交后代。如山茶花、百合和鸢尾杂交中均采用幼胚培养，成功地收到了杂交种子。同时，在杂交中受精困难，也可把未受精的胚珠分离出来，在试管内用花粉受精来解决，这在草本花卉花菱草中已取得成功。
单倍体育种：利用花药培养诱导花粉形成单倍体，在试管培养中通过秋水仙素处理，使染色体加倍，而成为纯合二倍体植物，从而缩短新品种育种的时间，还有利于突变中隐性突变的分离。这在花卉的株型、花色、花型的大小或重瓣，叶型、叶色等产生变异，往往有直接利用价值。这在矮牵牛的育种中已应用。
体细胞杂交和植物基因工程：利用原生质体遗传操作技术，可以从原来不大可能进行杂交的不同属植物间获得体细胞杂种或核质杂种。可以通过摄取外源目的基因，定向改造植物的某些重要性状。
3．植株脱病毒用无性繁殖方法来繁衍的花卉种类如菊花、香石竹、郁金香、百合、白鹤芋等，不能通过种子途径去除病毒，用化学方法防治和高温处理往往成效不稳定。作为组织培养的无性繁殖材料，最好是去病毒组织，否则易导致病毒积累，危害加重。而植物的茎尖部分无维管束，病毒难以侵入。所以，茎尖培养是获得无病毒植株的最好途径。至今，茎尖培养脱毒法已在菊花、百合、香石竹、郁金香等盆栽花卉上推广使用。
4．种质保存用无性繁殖的植物，因没有种子，只能在植物园内长期栽培保存，耗费大量的土地和劳力。种质材料还易受自然环境的变化和病虫危害而流失。若用组织培养方法，保存愈伤组织、胚状体、茎尖等组织，可节省大量人力和物力。
（二）组织培养的几个步骤
1．材料的选用一般用于组织培养的材料称为外植体。常分为两类。一类是带芽的外植体，如茎尖、侧芽、鳞芽、原球茎等，组织培养过程中可直接诱导丛生芽的产生。其获得再生植株的成功率较高，变异性也较小，易保持材料的优良性状。另一类主要是根、茎、叶等营养器官和花药、花瓣、花轴、花萼、胚珠、果实等生殖器官。这一类外植体需要一个脱分化过程，经过愈伤组织阶段，再分化出芽或产生胚状体，然后形成再生植株。
外植体的取用与组织部位、植株年龄、取材季节以及植株的生理状态、质量，都对培养时器官的分化有一定影响。一般阶段发育年幼的实生苗比发育年龄老的栽培品种容易分化，顶芽比腋芽容易分化，萌动的芽比休眠芽容易分化。在组织培养中，最常用的外植体是茎尖，通常切块在0．5厘米左右，太小产生愈伤组织的能力差，太大则在培养瓶中占据空间太多。培养脱毒种苗，常用茎尖分生组织部，长度为0．1毫米以下。
2．外植体的消毒植物组培能否取得成功的重要因素之一，就是保证培养物在无菌条件下安全生长。为此，必须抓好外植体的消毒和实行无菌操作。
由于培养的植物材料大都采集于田间栽培植株，材料上常附有各种微生物，一旦被带入培养基，即会迅速繁殖滋长，造成污染，培养失败。所以培养前必须对外植体进行严格的消毒处理，消毒的尺度为既能全都杀灭外植体上附带的微生物，但又不伤害材料的生活力。因此，必须正确选择消毒剂和使用的浓度、处理时间及程序。目前，常用的消毒剂有次氯酸钙、氯化汞、次氯酸钠、双氧水、酒精（70％）等。具体消毒方法如下：
（1）茎尖、茎、叶片的消毒消毒前先用清水漂洗干净或用软毛刷将尘埃刷除，茸毛较多的用皂液洗涤，然后再用清水洗去皂液，洗后用吸水纸吸干表面水分，用70％酒精浸数秒钟，取出后及时用10％次氯酸钙饱和上清液浸泡10～20分钟。或用2％～10％次氯酸钠溶液浸泡6～15分钟。消毒后用无菌水冲洗3次，用无菌纱布或无菌纸吸干接种。
（2）根、块茎、鳞茎的消毒这类材料大都生长在土中，常带有泥土，挖取时易遭损伤。消毒前必须先用净水清洗干净，在凹凸不平处以及鳞片缝隙处，均用毛笔或软刷将污物清除干净，用吸水纸吸干后，在70％酒精中浸一下，然后用6％～10％次氯酸钠溶液浸5～15分钟，或用0．1％～0．2％氯化汞消毒5～10分钟，最后用无菌水清洗3～4次，用无菌纱布或无菌纸吸干后接种。
（3）果实、种子的消毒这类材料有的表皮上具有茸毛或蜡质，消毒前先用70％酒精浸泡几秒钟或2～10分钟，然后用饱和漂白粉上清液消毒10～30分钟或2％次氯酸钠溶液浸10～20分钟，消毒后去除果皮，取出内部组织或种子接种。直接用种子或果实消毒，经消毒后的材料均须用无菌水多次冲洗后接种。
（4）花药、花粉的消毒植物的花药外面常被花瓣、花萼包裹着，一般处于无菌状态，只需采用表面消毒即可接种。通常先用70％酒精棉球擦拭花蕾或叶鞘，然后将花蕾剥出，在饱和漂白粉上清液中浸泡10～15分钟，用无菌水冲洗2～3次，吸干后即可接种。
3．组织培养的条件接种后的培养容器置放培养室，室温应控制在23～26℃，每天12～16小时光照，光照度为1000～3000勒克斯。
4．外植体的增殖接种后的外植体要分化出丛状芽、愈伤组织或胚状体，必须对培养基及激素的种类和浓度进行严格的设计和筛选。常用的基本培养基为MS培养基，激素的种类和浓度对外植体的分化和增殖起到重要的作用。也就是说不同的花卉种类对激素的种类和浓度是有差别的（表4－－3）。
5．诱导生根继代培养形成的不定芽和侧芽等一般没有根，要促使试管苗生根，必须转移到生根培养基上，生根培养基一般应用1／2MS培养基，因为降低无机盐浓度有利于根的分化。同时，不同盆栽花卉诱导生根时所需要的生长素的种类和浓度是不同的（表4－4）。一般常用吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）和吲哚丁酸（IBA）三种。一般在生根培养基中培养1个月左右即可获得健壮根系。
6．组培苗的移栽生根或形成根原基的试管苗从无菌，温、光、湿度稳定环境中进入到自然环境中，从异养过渡到自养过程，必须经过一个炼苗过程。首先打开试管瓶塞放阳光充足处让其锻炼1～2天，然后取出幼苗用温水将琼脂冲洗掉，移栽到泥炭、珍珠岩、蛭石、砻糠灰等组成的基质中，基质使用前需高温消毒，移栽后要适当遮荫，可用塑料薄膜覆盖，保持较高空气湿度，温度维持在25℃左右，勿使阳光直晒，7～10天后要注意通风和补充浇水，约20～40天，新梢开始生长后，小苗可转入正常管理。
许多植物的组织培养中发现有褐变现象，尤以木本植物组织培养中褐变严重。褐变主要发生在外植体、愈伤组织的继代、悬浮细胞培养、原生质体的分离与培养等。褐变产物不仅使外植体、细胞、培养基等变褐，而且对许多酶有抑制作用，从而影响培养材料的生长与分化，严重时甚至导致死亡。
[1] 褐变的机理正常细胞内，区域性分布使底物与PPO不能接触并不发生褐变，当细胞膜的结构发生变化和破坏时，酶和底物就结合在一块，在氧的作用下，生成醌，从而引起褐变。引起褐变的条件：氧、引起褐变的酶、底物，缺一不可。引起褐变的酶：多酚氧化酶（PPO是主要的）、过氧化物酶（POD）、、苯丙氨酸解氨酶等。引起褐变的酶的底物：主要是酚类化合物，可分成3类：第一类是苯基羧酸，包括邻羟基苯酚、儿茶酚、没食子酸、莽草酸等；第二类是苯丙烷衍生物，包括肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、单宁、木质素等；第三类是黄烷衍生物，包括花青素、黄酮、芸香苷等。
[2] 影响褐变的因素因子是复杂的，随植物的种类、基因型、外植体部位及生理状态等的不同，褐变的程度也有所不同。
A.植物种类及基因型红豆杉愈伤组织的诱导及继代培养过程中，常常发生培养细胞褐变现象，轻者影响细胞生长和繁殖，重者导致细胞死亡。豆科植物和芸苔属植物原生质体培养中容易褐化也是一个普遍的问题，橡胶的花药培养中，海垦2号花药的褐变较少，因而愈伤组织的诱导容易；而有些品系花药容易褐变，因而愈伤组织的诱导困难。在组织培养中，有些品种、品系难以成功，而有些则容易成功。油菜叶原生质体品种373褐化比品种94591、95386严重 B.外植体部位及生理状态荔枝茎的愈伤组织中度褐变，而根的愈伤组织全部褐变。欧洲栗幼年型的材料培养时含醌类物质少，成年型材料培养时含醌类物质多，后者比前者褐变严重。油棕幼嫩外植体（如胚）培养较少褐变，高度分化的叶片接种后则容易褐变。
C.培养基成分及培养条件硬紫草从长期继代培养且次生代谢物含量高引起培养物的褐变。用B5培养基可有效地防止褐变。茼蒿用甘露醇或蔗糖作为渗透压调节剂易发生褐变，不能或只能形成少量细胞团用葡萄糖作渗透压调节剂褐变较少，效果好。柿树ZT 9.13μmol/L、IAA 0.57μmol/L减轻褐变程度。BA或 KT 提高了褐变甘蔗组织培养中易产生褐变。荔枝培养基添加1 mg/L6-BA +0.5 mg/L 2,4-D时，愈伤组织较硬、增殖缓慢、易褐变；培养基添加1 mg/ L 6-BA+1 mg/L2,4-D时，愈伤组织浅黄疏松、增殖快[4]。 D.pH值影响材料的褐变大白菜pH值至6.5，很大程度上可抑制褐变。水稻pH值为4.5 ～5.0时，生长状态良好的，其表面呈黄白色，pH值为5.5 ～ 6.0时，愈伤组织严重褐变。
E.培养条件不适宜温度过高或光照过强，均可使PPO的活性提高，从而加速被培养的组织褐变。高浓度CO2也会促进褐变，其原因是环境中的CO2向细胞内扩散，使细胞内CO32+增多，产生褐变。
[3] 克服褐变的方法
a.选择适当的外植体成年植株比实生幼苗褐变的程度严重，夏季材料比冬季及早春和秋季的材料褐变的程度强。而冬季的芽进入深休眠状态，不太容易生长，所以最好选用早春和秋天的材料作为外植体。取材时还应注意外植体的基因型及部位，选择褐变程度较小的品种和部位作外植体。
b.对外植体进行预处理空白琼脂培养基中培养5-7天，使组织中的酚类物质部分渗入培养基中。再转移培养基2-3次，切口愈合后，褐变减轻。
c.选择适宜的培养基与培养条件设置不同试验，进行选择。
d.添加褐变抑制剂与吸附剂有机酸\抗坏血酸、半胱氨酸\柠檬酸、苹果酸和α-酮戊二酸\水解乳蛋白、植酸（PA）\SO2和亚硫酸盐\、脂肪氧化酶、抗坏血酸氧化酶\硫脲、二氨基二硫代甲酸钠、2-巯基苯并噻唑、氯化钠等也是PPO的抑制剂。聚乙烯吡咯烷酮（PVP）是酚类物质的专一性吸附剂，活性炭是一种吸附性较强的无机吸附剂，，能吸附各种微量物质和微小颗粒，
e.进行细胞筛选和多次转移进行细胞筛选，剔除易褐变的细胞。外植体接种后1~2天立即转移到新鲜培养基中或同一瓶培养基的不同部位，这样能减轻醌类物质对培养物的毒害作用，连续转移5~6次可基本解决外植体的褐变问题。
1、褐变的原因
很多植物尤其是木本植物体内含有较多的酚类化合物。在完整植物体的细胞中，酚类化合物和多酚氧化酶分隔存在，因此比较稳定。当外植体切割后，切口附近细胞的分割效应被打破，酚类化合物被多酚氧化酶氧化形成褐色的醌类化合物，醌类化合物又会在酪氨酸酶的作用下，与外植体组织中的蛋白质发生聚合，进一步引起其他酶系统失活，导致组织代谢紊乱，生长受阻，最终逐渐死亡。
2、影响褐变的因素
（1）植物基因型
在不同植物或同种植物不同基因型的组培过程中，褐变发生的频率和严重程度存在很大的差异，这是由于各种植物所含的单宁及其他酚类化合物的数量不同。一般木本植物的酚类化合物含量比草本植物高，更易发生褐变现象。核桃的单宁含量很高，不仅在接种初期发生褐变，在形成愈伤组织后还会因为褐变而死亡；苹果进行茎尖培养时，不同品种之间褐变的程度也不一样。对葡萄的研究也发现类似情况。
（2）外植体的生理状态
外植体的生理状态不同，接种后褐变程度不同。一般外植体的老化程度越高，其木质素的含量也越高，也就越容易褐变，成龄材料一般均比幼龄材料褐变严重。
另外切口越大，酚类物质的被氧化面也越大，褐变程度就会更严重。因此外植体的受伤程度对褐变的产生具有明显的影响，伤口加剧褐变的发生。仙客来小叶诱导时，整片叶接种较分成多块褐变要轻。除机械损伤外，各种消毒剂对外植体的伤害也会引起褐变，对于不易褐变的种类，用升汞消毒后，一般不会引起褐变，若用次氯酸钠进行消毒，则很容易引起褐变的发生。
（3）取材时间和部位
在不同的生长季节，植物体内酚类化合物含量和多酚氧化酶的活性不同。实验表明在苹果和核桃上，冬、春季取材褐变死亡率最低，夏季取材很容易褐变。在取材部位上幼嫩茎尖比其他部位褐变程度低，木质化程度高的节段在进行药剂消毒处理后褐变现象更为严重。
（4）培养基
在初代培养中，培养基中无机盐浓度过高，会引起酚类物质大量产生，导致褐变。BA和KT不仅促进酚类化合物合成，而且刺激多酚氧化酶的活性，增加褐变；而生长素类如NAA和2，4-D可延缓多酚合成，减轻褐变。采用液体培养基纸桥培养；可使外植体溢出的有毒物质很快扩散到液体培养基中，效果也很好。
（5）光照
在采取外植体前，如果将材料或母株枝条进行遮光处理，然后再切取外植体培养，能够有效地抑制褐变的发生。将接种后的初代培养材料在黑暗条件下培养，对抑制褐变发生也有一定的效果遮光抑制褐变的原因主要是由于氧化过程中，许多反应受酶系统控制，而酶系统活性受光照影响。但是，暗培养时间过长会降低外植体的生活能力，甚至引起死亡。
（6）温度
高温促进酚氧化，培养温度越高，褐变越严重，而低温可抑制酚类化合物氧化，降低多酚氧化酶的活性，从而减轻褐变。在15-25℃下培养卡特兰，比在25℃以上时褐变要轻，在17℃以下培养天竺葵茎尖比在17-27℃褐变要轻。
（7）培养时间
材料培养时间过长，会引起褐变物的积累，加重对培养材料的伤害。蝴蝶兰、香蕉等随着培养时间的延长，褐变程度会加剧，甚至在超过一定时间不进行转接，褐变物的积累还会引起培养材料的死亡。
3、褐变的防治措施
（1）选择适当的外植体
不同时期和年龄的外植体在培养中褐变的程度不同，选择适当的外植体是克服褐变的重要手段。避免在夏季高温季节取材，选择幼苗、褐变程度轻的品种和部位作为外植体。
（2）外植体预处理
对较易褐变的外植体可采取预处理措施，即先用流水冲洗外植体，然后放置在5℃左右的冰箱中低温处理12-14h。消毒后先接种到只含蔗糖的琼脂培养基中培养3-7d，使组织中的酚类物质部分渗入培养基中，取出外植体用0.1%的漂白粉溶液浸泡10min，然后再接种到合适的培养基上。
（3）筛选合适的培养基和培养条件
降低盐浓度，减少BA和KT的使用，采取液体培养，初期黑暗或弱光条件下培养，保持较低温度（15-20℃）也是降低褐变的有效方法。
（4）添加抗氧化剂和系缚剂
在培养基中添加抗氧化剂，或用抗氧化剂进行材料的预处理或预培养，可预防醌类物质的形成，对易褐变材料的培养有很好的辅助作用。常用的抗氧化剂有抗坏血酸、聚乙烯吡咯烷酮、牛血清蛋白、硫代硫蛋白等。添加1-5g/L的活性炭对酚类物质的吸附效果也很明显。
（5）连续转移
对易发生褐变的植物，在外植体接种后1-2d立即转移到新鲜培养基上,可减轻酚类物质对培养物的毒害作用,连续转移5-6次可基本解决外植体的褐变问题。
答：②组培室温度：组培室温度控制在20～2℃，可缓解玻璃化现象。另外，采用昼夜变温交替取代恒温也是错的选择。③适当提高培养基中蔗糖含在培养基中添加4％和3.5％的蔗糖，能分别较好地预防光叶楮和山桐子组培玻璃苗的发生。④调节培养基中植物生长调节剂的浓度和比例。4、褐变 植物种类、基因型及外植体...
答：因此,组织培养中降低污染率是工厂化生产中不可忽视的技术环节[1]。植物组织培养过程中造成污染的原因是多方面的,应根据具体情况从不同方面预防解决。1 外植体的消毒 要尽量选取带菌少的材料,如果室外栽培的材料污染太严重,就要采取一些预防措施:先将植物样本挖出,改为室内盆栽,喷布杀虫剂和杀菌剂,不便移栽的,可套...
答：由于培养的植物材料大都采集于田间栽培植株，材料上常附有各种微生物，一旦被带入培养基，即会迅速繁殖滋长，造成污染，培养失败。所以培养前必须对外植体进行严格的消毒处理，消毒的尺度为既能全都杀灭外植体上附带的微生物，但又不伤害材料的生活力。因此，必须正确选择消毒剂和使用的浓度、处理时间及程序...
答：一、在培养基中加入0.5～1％的活性炭。二、组培苗的褐化问题出现的原因：多种植物体中含有大量多酚类化合物，切取芽时的创伤会激活组织中的多酚氧化酶，将多酚类物质氧化为棕褐色的醌类物质，使外植体的切口处发生褐变，并会渗透到培养基中，使培养基褐化，其结果是严重影响培养物的生长和分化，甚至...
答：但在梨生根培养基中加人活性炭不仅不能促进生根，反而显著的抑制生根，主要原因可能是活性炭吸附了培养基中的生长素。3.用于胚培养，促进成苗 在许多植物的胚培养时，也用到了活性炭。甜柿含酚类物质较多，组培时褐变严重，从而增加了胚培养的难度，需添加抗氧化剂，研究发现，活性炭抗褐化效果比柠檬酸...
答：生命力旺盛的枝条,桉树无性系采穗圃里当年生的健壮枝条,或成年植株的基部萌条作为外植体,诱导容易,成活率可达到70%~80%以上;消毒剂的选择及消毒时间的长短桉树带芽茎段的消毒大多选用11%升汞和75%酒精相结合的消毒方式,茎段的木质化程度不同,酒精和升汞消毒的时间不一样,一般酒精消毒的时间为10~60s...
答：褐变产物不仅使外植体、细胞、培养基等变褐,而且对许多酶有抑制作用,从而影响培养材料的生长与分化,严重时甚至导致死亡。本文探讨植物组织培养中褐变现象的影响因素、机理及防范措施,对我们进行科学研究或工厂生产,包括植物组织的培养,原生质体、悬浮细胞和植物器官的培养都有着十分重要的现实意义。 1褐变产生的影响因素 ...
答：平吉成在研究小金海棠、八楞海棠和山定子刚生成的实生苗上切取茎尖进行组培的试验中，发现接种后褐变很轻。高度分化的叶片作为外植体，接种后则很容易褐变，而在幼嫩器官或组织中，褐变则较轻。植物体内酚类化合物含量、PPO活性与外植体所处的生长季节有关，而PPO活性和酶类含量有正相关性，春秋季较弱，...
答：c、培养基成分 浓度过高的无机盐会使某些观赏植物的褐变程度增加,此外,细胞分裂素的水平过高也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性,从而使褐变现象加深. d、培养条件不当 如果光照过强、温度过高、培养时间过长等,均可使多酚氧化酶的活性提高,从而加速被培养的外植体的褐变程度. 为了提高组织培养的成苗率,必须对外植...
答：以茎段进行组织培养比较容易,一般取植物的嫩茎切段作为外植体,切成0.5~1cm长的小段进行接种,保证每个茎段有一个芽点和一片叶子,将芽点部位以下垂直插入培养基凝胶中进行生根培养。 14.外植体接种需要注意的操作事项 接种前首先进行灭菌消毒,接种所用的镊子、解剖刀、剪刀等工具需要提前高温高压灭菌,提前10分钟打开...
