Dische比色法具体是怎样操作?
噻唑蓝（MTT）比色法操作注意事项
噻唑蓝（MTT）：四唑盐
原理：
MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法.活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与活细胞数成正比。
优点：简单快速、灵敏、经济
缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。
应用：新药筛选、细胞毒牲试验、肿瘤放射敏感性实验等
MTT主要有两个用途
1）药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定；
2） 细胞增殖及细胞活性测定。
比色法操作注意事项
1） 选择适当的细胞接种浓度，保证细胞培养结束时浓度不至于过满。
2） 种板技术：均匀。
3） 实验时应设置调零孔，溶媒孔，加药孔。
调零孔：培养基、MTT、DMSO。（无细胞）
溶媒孔：培养液、MTT、DMSO、细胞、溶酶。
加药孔：培养液、MTT、DMSO、细胞、不同浓度的药物。
（一般5-7个梯度，设3-5个复孔）
4）避免血清干扰：一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。
5）边缘效应：周边孔加入PBS。
6）MTT的配置： MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液。4℃下避光保存2周。
7）孔板的重复利用（1.做完MTT后用大水流尽量将板冲净，然后用洗衣粉水泡几个小时（小心最好让洗衣粉先化开）。2.用自来水冲净洗衣粉水，倒扣晾干.3.重铬酸钾加浓硫酸配成的酸液中浸泡过夜泡洗液（六小时以上即可）后自来水洗净（20次左右）每个孔都要处理4.用去离子水冲洗3遍，双蒸水冲洗3遍，烤干5.超净台中紫外线照射2个小时左右，就可以用了，不可以高压。或泡酸过夜，dd水冲洗干净，烘干或者晾干后紫外照射30min以上即可使用。
8）MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。
9）在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。
10）MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套。
11）配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以操作台上的照明灯关掉。
原理：
比色分析是基于溶液对光的选择性吸收而建立起来的一种分析方法，又称吸光亮度法。
有色物质溶液的颜色与其浓度有关，溶液的浓度越大，颜色越深，利用光学比较溶液颜色的深度，可以测定溶液的浓度。
根据吸收光的波长范围不同以及所使用的仪器精密程度，可分为光电比色法和分光亮度法等。
步骤
1. 用相同型号的比色管。
2. 配制等体积的系列标准样品。
3. 配制待测样品(与标准样品等体积)。
4. 对比，找出相同的浓度。
1 材料与仪器
0.1% 咔唑试液(50 mg咔唑溶于50 mL 95%乙醇)，葡萄糖醛酸(GlcA)、半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)、鼠李糖(Rha)、果糖(Fru)均为化学纯，枸杞多糖样品LbGP3，LbGP4，LbP1，LbP2，LbP3由本课题组提供。722分光光度计。
2 方法与结果
2.1 常用的硫酸-咔唑法
2.1.1 标准曲线绘制：精确称取干燥的单糖标准样品10 mg，定容于25 mL容量瓶中。然后准确量取0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 mL单糖标准溶液于带塞试管中，各管加水至1 mL。在冰水浴中向各管加入6 mL浓硫酸，摇匀后，改在85 ℃水浴中保持20 min，取出后冷至室温，各管加0.2 mL咔唑液，在室温下保持2 h，测定吸收度(530 nm)，以浓度对吸收度作标准曲线。
2.1.2 测定各单糖在530 nm处的检测响应：分别准确吸取各种单糖溶液(10 mg/25 mL)0.4 mL，补水至1 mL用2.1.1项下方法测得其吸收值，结果如表1。
表1 咔唑法测定时各单糖在530 nm处的吸收值
Gal Glc Man Xyl Ara Rha Fru GalA GlcA
0.0493 0.1018 0.0503 0.0840 0.0251 0.0140 0.1245 0.2603 0.2498
上述结果表明，用咔唑法测定时，天然多糖化合物中常见的各种中性单糖在530 nm处也均有程度不同的吸收。
2.2 各单糖浓度与咔唑法测定时在530 nm处吸收值的线性关系：以常用咔唑法(参考2.1.1)测定各单糖吸收标准曲线(其中GalA和GlcA标准溶液的配制为精确称取干燥的糖醛酸10 mg溶于100 mL容量瓶)，其线性回归方程及相关系数如下。
Glc Y=0.4631X+0.004939(r=0.9996)
Gal Y=0.2358X+0.004567(r=0.9993)
Man Y=0.1587X+0.002963(r=0.9998)
Xyl Y=0.2559X+0.000884(r=0.9997)
Fru Y=0.1727X+0.001872(r=0.9960)
Rha 吸收值基本保持不变
GalA Y=0.5857X+0.005917(r=0.9998)
GlcA Y=0.4264X+0.000601(r=0.9999)
上述结果可知，各中性单糖在0.04～0.32 mg/mL范围内、GalA和GlcA在0.01～0.08 mg/mL范围内各单糖浓度与咔唑法检测吸收值呈线性。
2.3 定量考察各中性单糖对咔唑法测定糖醛酸含量的影响
2.3.1 分别准确量取GalA和GlcA(10 mg/100 mL)0.4 mL，各加入0.0，0.4，0.6 mL各中性单糖溶液(10 mg/25 mL)，分别补水至1 mL，按咔唑法测其吸收值。
2.3.2 分别准确量取各中性单糖溶液(10 mg/25 mL)0.0，0.4，0.6 mL，分别补水至1 mL，按咔唑法测其吸收值。得数据如表2。
表2 各种中性单糖对糖醛酸影响的定量考察结果
A530 加入标准中性糖体积(mL) A530 加入标准中性糖体积(mL)
0.0 0.4 0.6 0.0 0.4 0.6
GalA+Glc 0.2738 0.3732 0.3920 GlcA+Glc 0.2438 0.3506 0.4043
Glc 0.0000 0.1017 0.1377 Glc 0.0000 0.1183 0.1741
(GalA+Glc)Glc 0.2738 0.2715 0.2543 (GlcA+Glc)Glc 0.2438 0.2323 0.2302
GalA+Gal 0.2549 0.3059 0.3495 GlcA+Ga1 0.2603 0.3143 0.3406
Gal 0.0000 0.0513 .0914 Gal 0.0000 0.0473 0.1051
(GalA+Gal)Gal 0.2549 0.2546 0.2584 (GlcA+Gal)Gal 0.2603 0.2670 0.2355
GalA+Man 0.2636 0.3152 0.3100 GlcA+Man 0.2403 0.3050 0.3101
Man 0.0000 0.0463 0.0552 Man 0.0000 0.0533 0.0854
(GalA+Man)Man 0.2636 0.2636 0.2548 (GlcA+Man)Man 0.2403 0.2517 0.2247
GalA+Xyl 0.2692 0.3455 0.3837 GlcA+Xyl 0.2600 0.3432 0.3710
Xyl 0.0000 0.0759 0.1275 Xyl 0.0000 0.084 0.1072
(GalA+Xyl)Xyl 0.2692 0.6296 0.2562 (GlcA+Xyl)Xyl 0.2600 0.2592 0.2638
GalA+Rha 0.2218 0.2400 0.2223 GlcA+Rha 0.2204 0.2370 0.2215
Rha 0.0000 0.0090 0.0170 Rha 0.0000 0.0100 0.0120
(GalA+Rha)Rha 0.2218 0.2310 0.2063 (GlcA+Rha)Rha 0.2204 0.2270 0.2095
GalA+Fru 0.2444 0.3721 0.4432 GlcA+Fru 0.2204 0.3585 0.4335
Fru 0.0000 0.1345 0.2191 Fru 0.0000 0.1103 0.2097
(GalA+Fru)Fru 0.2444 0.2376 0.2241 (GlcA+Fru)Fru 0.2204 0.2482 0.2338
GalA+Ara 0.2551 0.2678 0.3125 GlcA+Ara 0.2360 0.2619 0.28885
Ara 0.0000 0.0072 0.0539 Ara 0.0000 0.0254 0.0558
(GalA+Ara)Ara 0.2551 0.2606 0.2586 (GlcA+Ara)Ara 0.2360 0.2365 0.2327
上述实验结果表明样品的吸收值随中性糖的含量增加而增大(Rha除外)，而样品吸收值与中性糖吸收值之差和糖醛酸的吸收值基本一致。
2.4 改进的硫酸-咔唑法：根据2.3的实验结果，我们提出一种改进的硫酸-咔唑法测定糖醛酸含量的方法，即样品的吸收值减去中性糖的吸收值为样品的吸收值。
2.4.1 标准溶液的配制
溶液1.准确量取GalA(10 mg/100 mL)0.2 mL，加入0.2 mL Gal(10 mg/25 mL)和0.2 mL Glc(10 mg/25 mL)，补水至1 mL。
溶液2.准确量取GalA(10 mg/100 mL)0.4 mL，加入0.2 mL Gal(10 mg/25 mL)和0.2 mL Glc(10 mg/25 mL)，补水至1 mL。
溶液3.准确量取GalA(10 mg/100 mL)0.6 mL，加入0.2 mL Gal(10 mg/25 mL)和0.2 mL Glc(10 mg/25 mL)，补水至1 mL。
中性单糖溶液.量取0.2 mL Gal(10 mg/25 mL)和0.2 mL Glc(10 mg/25 mL)，补水至1 mL。
2.4.2 方法改进前后糖醛酸测定结果的比较：上述中性单糖溶液按咔唑法测定在530 nm处的吸收值为0.0442。
表3所列结果表明，改进的咔唑法所测得的标准溶液中糖醛酸吸收值与实际测定值基本一致，因此这种改进的硫酸-咔唑法在测定各种样品中糖醛酸的含量时，排除了样品中中性糖对测定的影响，因而要比常用的硫酸-咔唑法准确。
表3 不同方法的糖醛酸测定结果
溶液1 溶液2 溶液3
咔唑法测定值 0.1497 0.2482 0.3628
改良咔唑法测定值 0.1055 0.2040 0.3186
糖醛酸实际值 0.1092 0.2058 0.3207
注：改进的咔唑法测定值为常用咔唑法测定值与标准配制溶液中中性单糖吸收值(0.0442)之差。
2.5 改进的咔唑法测定糖醛酸实例：从枸杞子中分离得到的多糖样品LbGP3，LbGP4，LbP1，LbP2和LbP3中的糖醛酸含量测定，具体操作如下：
2.5.1 样品中中性糖吸收值的测定：要求得样品中中性糖对检测的吸收干扰值，首先必须知道其中中性糖的含量和组成比。根据蒽酮-硫酸法〔4〕可测得中性糖的含量。组成比的测定需先将样品全水解〔5〕，然后再用HPLC或GC测得样品中各中性单糖的组成比。以此称取各种相应标准中性单糖配成混合液，然后取1 mL溶液于带塞试管中，然后按2.1.1所述的标准曲线制备操作，测得其吸收值。
2.5.2 样品的吸收值测定：按咔唑法(方法同2.1.1)，测得样品吸收值(注：样品中中性糖浓度应在其线性范围内)。
2.5.3 样品中糖醛酸含量的测定：样品中糖醛酸的吸收值为样品吸收值与中性糖吸收值之差，再根据对应标准的回归方程，计算出该样品中糖醛酸含量。实验结果如表4所示。
表4 常用的与改进的咔唑法测定糖醛酸含量结果的比较
糖醛酸含量(%)
多糖样品 常用咔唑法 改进咔唑法
LbGP3 5.3 3.4
LbGP4 10.4 6.4
LbP1 8.8 5.9
LbP2 8.1 6.7
LbP3 8.7 5.7
从表4结果可以看出常用咔唑法测定糖醛酸的含量其值偏高。
3 讨论
在咔唑法所规定的测定波长下，中性戊糖和中性己糖均有吸收，影响糖醛酸含量测定的准确性。为此我们对7种不同的中性糖分别进行了考察，测得其浓度与吸收值的线性范围。实验结果表明Xyl，Man，Glc，Gal，Fru分别找到了各自的线性范围，Rha随着浓度的改变其吸收值基本保持不变，Ara较难判断。各种单糖线性范围的测得，不仅证实了中性糖的存在对咔唑法测定糖醛酸的结果产生干扰，而且为提出一种比常用咔唑法准确性高的糖醛酸测定方法提供了实验依据。
用咔唑法测定各种中性单糖对糖醛酸影响的定量考察实验表明，糖醛酸和各中性单糖在其各自的线性范围内取样，样品的吸收值与中性糖吸收值之差与不含中性糖的糖醛酸实际测得吸收值基本一致。
答：组成比的测定需先将样品全水解〔5〕，然后再用HPLC或GC测得样品中各中性单糖的组成比。以此称取各种相应标准中性单糖配成混合液，然后取1 mL溶液于带塞试管中，然后按2.1.1所述的标准曲线制备操作，测得其吸收值。2.5.2 样品的吸收值测定：按咔唑法(方法同2.1.1)，测得样品吸收值(注：样品...
