谁做过酶切质粒的实验啊，制感受态细胞然后转化呢？求详细过程及注意要点！
kuaidi.ping-jia.net 作者：佚名 更新日期：2024-06-28
感受态细胞的制备时有什么注意事项
第一天： 1. 将适合菌株（如XL1-Blue, DH5α）置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37°C下过夜培养 2. 高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）以备第二天摇瓶用 3. 准备几瓶灭菌水（总量约1.5升），保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用 第二天： 4. 转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB（或其他营养丰富的培养基）的1-2升挡板摇瓶中 5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时 6. 定时监控O.D.600值（培养1小时后每半小时测定一次） 7. 当O.D.600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15分钟（需要的话这种方式可以存放培养液数小时） 8. 细胞在4°C 5000g下离心15分钟，弃上清液（如需要，沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天） 9. 用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中（几毫升），然后加水稀释至离心管的2/3体积。 10. 照上面步骤重复离心，小心弃去上清液 11. 照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞 12. 离心，弃上清液 13. 用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞
14. 照上面步骤离心，小心弃去上清液（沉淀可能会很松散） 15. 用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml 16. 将细胞按150μl等份装入微量离心管，于-80°C保存
转化方法:1. 在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ，冰上培育约5分钟 2. 添加1-3μl DNA ，冰上培育约5分钟 3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器（无泡）中 4. 加载P1000，准备好300μl LB 或 2xYT 5. 对电穿孔容器进行脉冲（200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏）（检查时间常数，应该在3以上） 6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中 7. 37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原 8. 转移细胞至适当的选择培养基上培养
大肠杆菌感受态细胞制备及转化中的影响因素
1、 感受态细胞的概念
重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。
在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。
所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。
制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。
2、 转化的概念及原理
在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，
使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。
受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），该法最先是由Cohen于1972年发现的。其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。
Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×106~2×107转化子/ug质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。如在Ca2+的基础上，联合其它的二价金属离子（如Mn2+、Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100~1000倍。
化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70℃保存，因此被广泛用于外源基因的转化。
除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到109~1010转化子/ug闭环DNA。因操作简便，愈来愈为人们所接受。
3、 感受态细胞制备及转化中的影响因素
⑴、细胞的生长状态和密度
最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已
经过多次转接，及贮存在4℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600控制。对TG1菌株，OD600为0．5时，细胞密度在5×107个/ml左右。（应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。密度过高或不足均会使转化率下降。
此外，受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。
⑵、质粒DNA的质量和浓度
用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。一般地，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%，1ng的cccDNA即可使50ul的感受态细胞达到饱和。
对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，实验证明，大于30kb的重组质粒将很难进行转化。此外，重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10~100倍，因此重组DNA大都构成环状双螺旋分子。
整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。
⑸、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。
大肠杆菌感受态细胞制备及外源DNA的转化
实验目的
1.了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。
2.学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。
3.学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。
实验原理
转化( Transformation )是将异源 DNA 分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术。
转化中的受体细胞： 转化过程所用的受体细胞一般是限制性修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，常用 RM 符号表示。
转化方法：电击法、 CaCl2、 RuCl等化学试剂法
感受态细胞：处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源 DNA 分子通过时细胞的状态。
转化细胞(转化子)：带有异源 DNA 分子的受体细胞( Transformant )。
本实验以 E.coli DH5α 菌株为受体细胞，用 CaCl2 处理受体菌使其处于为感受态，然后与 pUC18质粒共保温，实现转化。 pUC18质粒携带有抗氨苄青霉素的基因，因而使接受了该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉的特性，用 Apr符号表示。将经过转化后的全部受体细胞经过适应稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。
影响转化率的因素
细胞生长状态和密度。
转化的质粒 DNA 的质量和浓度。
试剂的质量。防止杂菌和其它外源 DNA 的污染。
实验仪器 离心设备
实验试剂大肠杆菌DH5αLB培养基，0.1mol/LCaCl2溶液（预冷）氨苄青霉素pUC18质粒
实验步骤
菌株活化:
1.用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5α，在LB培养基平板表面划线，于37℃培养16小时
2.挑取一个单菌落，转到3－5mlLB培养基中，于37℃培养3－5小时
3.将培养液全部转到100mlLB培养基中培养2－3小时，到OD600＝0.3－0.4感受态细胞制备:
4.将培养液转入1.5ml离心管中，在冰上放置15－30min
5.4000rpm离心5min,弃上清
6.加入0.8ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，冰上预冷10min
7.4000rpm离心5 min,弃上清
8.加入0.2ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，即可使用。也可加入总体积15％的甘油 可－70℃长期保存
外源DNA的转化:
9.取目的DNA加入大肠杆菌感受态细胞中，于冰上放置30min
10.于42℃水浴90S
11.冰上放置2min
12.加入800μlLB液体培养基于37培养1小时
13.将培养液均匀涂布在含Amp+的培养基平板上
14.将平板放置于37℃恒温培养箱中培养12-14个小时，然后观察结果
对照组
对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。
对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。
转化率统计每个培养皿中的菌落数。
转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：
转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积
转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg)
感受态细胞总数＝对照组2菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积
感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数
细胞株前的BEL什么意思
谁做过酶切质粒的实验啊,制感受态细胞然后转化呢?求详细过程及注意要点...
答：一般地,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%,1ng的cccDNA即可使50ul的感受态细胞达到饱和。对于以质粒为载体的重组分子而言,分子量大的转化效率低,实验证明,大于30kb的重组质粒将很难进行转化。此外,重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关,环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10~100倍,因此重组DNA大...
问一下做过感受态的人。大家帮忙仔细回忆一下制作感受态的全过程需要...
答：菌种，离心管，氯化钙，LB培养基，水浴锅，冰水混合物，离心机，差不多了吧
感受态细胞的制备时有什么注意事项
答：1、培养温度。较低的温度培养有利于感受态的形成，这样可以获得较高的感受态，但太低又不实用，因而产生了 Inoue 的高效感受态制备方法，它实际是利用了所有有利于感受态的文献而得出的一个非常理想方法。2、在保存感受态时，DMSO 要比甘油的效果要好，它会使感受态的效率增加。3、液氮速冻也会使感受态的...
质粒双酶切后怎么会这个样子
答：酶切前,质粒电泳图一般是三条条带,并认为这三条带从上到下一次是线性、开环、超螺旋.其实可能会比这条带更多些,可以认为是中间复合体状态.酶切后,因为超螺旋状态的质粒被切成线性,所以条带会有一条条带.如果是双酶切,或是质粒上的酶切位点比较多的话,会有两条或更多条带.重组质粒是把载体质...
我做质粒酶切实验,需要大量质粒。从含抗生素的平板中挑菌后接种,然后在...
答：1. 建议重新配置LB培养液 2. 确保菌种是新鲜的，如果过于老旧，建议重新涂盘（抗生素选择盘），挑克隆。3. 最后实在不行，可以适当降低培养液中抗生素的浓度
DNA重组技术步骤如何?
答：DNA重组技术步骤如下：一、质粒DNA 提取的pQE-31和pUC18-CAT 质粒。二、制备重组DNA 1. 在灭菌的1.5mL 离心管中，加入pQE-31质粒10mL(2mg／mL)，2mL酶切缓冲液，1mL BamHI 和HindIII酶 的混合液（各含10个单位），无菌双蒸水7mL，至反应混合物总体积为20mL，离心混匀，37℃反应过夜。2. 在...
大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒的转化结果怎么分析?
答：CaCl2法制备感受态的原理感受态细胞的制备质粒的转化 转化子的筛选 材料及方法 菌种：大肠杆菌BL21菌株 质粒：pGEX-6P-1感受态制备方法：CaCl2法 转化方法：热激法 CaCl2制备感受态的原理。细菌处于0·C，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于...
各位高手,请教一下,我做质粒的单酶切、与目的片段连接、转化,老是没...
答：包括酶切回收buffer没有洗脱干净，或者留有酒精（对连接酶来说是比较致命的一点），或者最后的溶解buffer的酸碱值有问题，都会影响到细菌接受质粒的。建议你重新换一个酶切回收试剂盒。并且每一步都做好平行对照。查找出问题所在。百替生物专业提供克隆构建服务。有需要也可以寻求公司的帮助。
...xba1)连接后电转感受态细胞,同时将质粒酶切回收的片段转化做对照_百 ...
答：质粒是双酶切后，加连接酶的生长表示双酶切不完全，未加连接酶生长表示你用的没能完全酶切你的质粒，最好加连接酶对照也做吧
感受态细胞制作前为何要培养3h左右使OD600达到0.6左右?
答：感受态细胞（competent cells）是一种能够容易地吸收外源DNA的细胞，常用于基因转染、质粒转移等分子生物学实验中。在制作感受态细胞时，将菌株在特定条件下处理，使其表现出更强的吸收外源DNA的能力。其中，培养3小时左右使OD600达到0.6左右的步骤是为了在接下来的化学处理和电击处理中提高细胞的水平和稳定...
感受态细胞的制备时的注意事项：
1、培养温度。较低的温度培养有利于感受态的形成，这样可以获得较高的感受态，但太低又不实用，因而产生了 Inoue 的高效感受态制备方法，它实际是利用了所有有利于感受态的文献而得出的一个非常理想方法。
2、在保存感受态时，DMSO 要比甘油的效果要好，它会使感受态的效率增加。
3、液氮速冻也会使感受态的效率提高，因此推荐用液氮速冻感受态，然后保存于超低温冰箱内。
4、冻存的感受态用一次拿一管，不要反复冻融。化冻之后立即使用，不要冰上放太久。
5、操作时可以轻弹轻甩，尽量避免用移液器吹吸。
扩展资料：
感受态细胞（competent cell）：理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。
主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大，直观的说，使得细胞膜表面出现一些孔洞，便于外源基因或载体进入感受态细胞。由于细胞膜的流动性，这种孔洞会被细胞自身所修复。
将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。
参考资料来源：百度百科--感受态细胞
此外（1）质粒DNA的质量和浓度，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10~100倍，则会使转化率下降;ml左右，且注意防止被其它试剂。（应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同），大于30kb的重组质粒将很难进行转化：所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的。对TG1菌株。所有的试剂都要灭菌。对于以质粒为载体的重组分子而言： 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，并经高压灭菌处理，1ng的cccDNA即可使50ul的感受态细胞达到饱和。一般地。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳，所用器皿，并用最纯净的水配制，细胞密度在5×107个/：整个操作过程均应在无菌条件下进行，分子量大的转化效率低，移液枪头等最好是新的，不能离开冰浴，重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，否则细胞转化率将会降低，可通过测定培养液的OD600控制、DNA酶或杂DNA所污染，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比。密度过高或不足均会使转化率下降。不要用已经过多次转接。（二）感受态细胞转化中的影响。（2）感受态细胞的质量。整个操作均需在冰上进行，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%，实验证明，及贮存在4℃的培养菌液，因此重组DNA大都构成环状双螺旋分子，最好分装保存于4℃ （3）细胞的生长状态和密度 最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。即应用对数期或对数生长前期的细菌，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，OD600为0．5时，如离心管
大肠杆菌电转化感受态细胞制备第一天： 1. 将适合菌株（如XL1-Blue, DH5α）置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37°C下过夜培养 2. 高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）以备第二天摇瓶用 3. 准备几瓶灭菌水（总量约1.5升），保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用 第二天： 4. 转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB（或其他营养丰富的培养基）的1-2升挡板摇瓶中 5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时 6. 定时监控O.D.600值（培养1小时后每半小时测定一次） 7. 当O.D.600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15分钟（需要的话这种方式可以存放培养液数小时） 8. 细胞在4°C 5000g下离心15分钟，弃上清液（如需要，沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天） 9. 用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中（几毫升），然后加水稀释至离心管的2/3体积。 10. 照上面步骤重复离心，小心弃去上清液 11. 照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞 12. 离心，弃上清液 13. 用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞
14. 照上面步骤离心，小心弃去上清液（沉淀可能会很松散） 15. 用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml 16. 将细胞按150μl等份装入微量离心管，于-80°C保存
转化方法:1. 在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ，冰上培育约5分钟 2. 添加1-3μl DNA ，冰上培育约5分钟 3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器（无泡）中 4. 加载P1000，准备好300μl LB 或 2xYT 5. 对电穿孔容器进行脉冲（200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏）（检查时间常数，应该在3以上） 6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中 7. 37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原 8. 转移细胞至适当的选择培养基上培养
大肠杆菌感受态细胞制备及转化中的影响因素
1、 感受态细胞的概念
重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。
在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。
所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。
制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。
2、 转化的概念及原理
在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，
使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。
受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），该法最先是由Cohen于1972年发现的。其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。
Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×106~2×107转化子/ug质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。如在Ca2+的基础上，联合其它的二价金属离子（如Mn2+、Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100~1000倍。
化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70℃保存，因此被广泛用于外源基因的转化。
除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到109~1010转化子/ug闭环DNA。因操作简便，愈来愈为人们所接受。
3、 感受态细胞制备及转化中的影响因素
⑴、细胞的生长状态和密度
最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已
经过多次转接，及贮存在4℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600控制。对TG1菌株，OD600为0．5时，细胞密度在5×107个/ml左右。（应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。密度过高或不足均会使转化率下降。
此外，受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。
⑵、质粒DNA的质量和浓度
用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。一般地，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%，1ng的cccDNA即可使50ul的感受态细胞达到饱和。
对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，实验证明，大于30kb的重组质粒将很难进行转化。此外，重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10~100倍，因此重组DNA大都构成环状双螺旋分子。
整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。
⑸、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。
大肠杆菌感受态细胞制备及外源DNA的转化
实验目的
1.了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。
2.学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。
3.学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。
实验原理
转化( Transformation )是将异源 DNA 分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术。
转化中的受体细胞： 转化过程所用的受体细胞一般是限制性修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，常用 RM 符号表示。
转化方法：电击法、 CaCl2、 RuCl等化学试剂法
感受态细胞：处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源 DNA 分子通过时细胞的状态。
转化细胞(转化子)：带有异源 DNA 分子的受体细胞( Transformant )。
本实验以 E.coli DH5α 菌株为受体细胞，用 CaCl2 处理受体菌使其处于为感受态，然后与 pUC18质粒共保温，实现转化。 pUC18质粒携带有抗氨苄青霉素的基因，因而使接受了该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉的特性，用 Apr符号表示。将经过转化后的全部受体细胞经过适应稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。
影响转化率的因素
细胞生长状态和密度。
转化的质粒 DNA 的质量和浓度。
试剂的质量。防止杂菌和其它外源 DNA 的污染。
实验仪器 离心设备
实验试剂大肠杆菌DH5αLB培养基，0.1mol/LCaCl2溶液（预冷）氨苄青霉素pUC18质粒
实验步骤
菌株活化:
1.用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5α，在LB培养基平板表面划线，于37℃培养16小时
2.挑取一个单菌落，转到3－5mlLB培养基中，于37℃培养3－5小时
3.将培养液全部转到100mlLB培养基中培养2－3小时，到OD600＝0.3－0.4感受态细胞制备:
4.将培养液转入1.5ml离心管中，在冰上放置15－30min
5.4000rpm离心5min,弃上清
6.加入0.8ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，冰上预冷10min
7.4000rpm离心5 min,弃上清
8.加入0.2ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，即可使用。也可加入总体积15％的甘油 可－70℃长期保存
外源DNA的转化:
9.取目的DNA加入大肠杆菌感受态细胞中，于冰上放置30min
10.于42℃水浴90S
11.冰上放置2min
12.加入800μlLB液体培养基于37培养1小时
13.将培养液均匀涂布在含Amp+的培养基平板上
14.将平板放置于37℃恒温培养箱中培养12-14个小时，然后观察结果
对照组
对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。
对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。
转化率统计每个培养皿中的菌落数。
转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：
转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积
转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg)
感受态细胞总数＝对照组2菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积
感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数
细胞株前的BEL什么意思
答：一般地,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%,1ng的cccDNA即可使50ul的感受态细胞达到饱和。对于以质粒为载体的重组分子而言,分子量大的转化效率低,实验证明,大于30kb的重组质粒将很难进行转化。此外,重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关,环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10~100倍,因此重组DNA大...
答：菌种，离心管，氯化钙，LB培养基，水浴锅，冰水混合物，离心机，差不多了吧
答：1、培养温度。较低的温度培养有利于感受态的形成，这样可以获得较高的感受态，但太低又不实用，因而产生了 Inoue 的高效感受态制备方法，它实际是利用了所有有利于感受态的文献而得出的一个非常理想方法。2、在保存感受态时，DMSO 要比甘油的效果要好，它会使感受态的效率增加。3、液氮速冻也会使感受态的...
答：酶切前,质粒电泳图一般是三条条带,并认为这三条带从上到下一次是线性、开环、超螺旋.其实可能会比这条带更多些,可以认为是中间复合体状态.酶切后,因为超螺旋状态的质粒被切成线性,所以条带会有一条条带.如果是双酶切,或是质粒上的酶切位点比较多的话,会有两条或更多条带.重组质粒是把载体质...
答：1. 建议重新配置LB培养液 2. 确保菌种是新鲜的，如果过于老旧，建议重新涂盘（抗生素选择盘），挑克隆。3. 最后实在不行，可以适当降低培养液中抗生素的浓度
答：DNA重组技术步骤如下：一、质粒DNA 提取的pQE-31和pUC18-CAT 质粒。二、制备重组DNA 1. 在灭菌的1.5mL 离心管中，加入pQE-31质粒10mL(2mg／mL)，2mL酶切缓冲液，1mL BamHI 和HindIII酶 的混合液（各含10个单位），无菌双蒸水7mL，至反应混合物总体积为20mL，离心混匀，37℃反应过夜。2. 在...
答：CaCl2法制备感受态的原理感受态细胞的制备质粒的转化 转化子的筛选 材料及方法 菌种：大肠杆菌BL21菌株 质粒：pGEX-6P-1感受态制备方法：CaCl2法 转化方法：热激法 CaCl2制备感受态的原理。细菌处于0·C，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于...
答：包括酶切回收buffer没有洗脱干净，或者留有酒精（对连接酶来说是比较致命的一点），或者最后的溶解buffer的酸碱值有问题，都会影响到细菌接受质粒的。建议你重新换一个酶切回收试剂盒。并且每一步都做好平行对照。查找出问题所在。百替生物专业提供克隆构建服务。有需要也可以寻求公司的帮助。
答：质粒是双酶切后，加连接酶的生长表示双酶切不完全，未加连接酶生长表示你用的没能完全酶切你的质粒，最好加连接酶对照也做吧
答：感受态细胞（competent cells）是一种能够容易地吸收外源DNA的细胞，常用于基因转染、质粒转移等分子生物学实验中。在制作感受态细胞时，将菌株在特定条件下处理，使其表现出更强的吸收外源DNA的能力。其中，培养3小时左右使OD600达到0.6左右的步骤是为了在接下来的化学处理和电击处理中提高细胞的水平和稳定...
