基因克隆的基本步骤有哪些
基因克隆技术包括了一系列技术，它大约建立于70年代初期。美国斯坦福大学的伯格（P.Berg）等人于1972年把一种猿猴病毒的DNA与λ噬菌体DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来，于是产生了一种新的重组DNA分子，从此产生了基因克隆技术。1973年，科恩（S.Cohen）等人把一段外源DNA片段与质粒DNA连接起来，构成了一个重组质粒，并将该重组质粒转入大肠杆菌，第一次完整地建立起了基因克隆体系。
一般来说，基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。因此基因克隆技术又称为分子克隆、基因的无性繁殖、基因操作、重组DNA技术以及基因工程等。
采用重组DNA技术，将不同来源的DNA分子在体外进行特异切割，重新连接，组装成一个新的杂合DNA分子。在此基础上，这个杂合分子能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子，此过程叫基因克隆。
简单的说一下：
扩增目的基因，比如通过PCR的方法。
PCR扩增的序列可以通过酶切或者TOPO TA的方法插入到载体质粒。
转染大肠杆菌
筛选阳性克隆一般常采用蓝白克隆方法，就是在载体上，序列的插入位置本来是一个完整编码β-gal这个酶的序列，如果不被破坏，产生的酶可以降解细菌培养盘上的底物，形成蓝色产物。如果有目的序列插入，这个酶就不能表达，形成的克隆就是白色的。
挑取阳性克隆，测序确认无变异和方向后，扩增质粒，提纯质粒。
基因克隆的基本步骤流程如下：
一、目的DNA片段的获得：
DNA克隆的第一步是获得包含目的基因在内的一群DNA分子，这些DNA分子或来自于目的生物基因组DNA或来自目的细胞mRNA逆转录合成的双链 cDNA分子。
由于基因组DNA较大，不利于克隆，因此有必要将其处理成适合克隆的DNA小片段，常用的方法有机械切割和核酸限制性内切酶消化。若是基因序列已知而且比较小就可用人工化学直接合成。如果基因的两端部分序列已知，根据已知序列设计引物，从基因组DNA 或cDNA中通过PCR技术可以获得目的基因。
二、载体的选择：
基因克隆常用的载体有：质粒载体、噬菌体载体、柯斯质粒载体、单链DNA噬菌体载体、噬粒载体及酵母人工染色体等。从总体上讲，根据载体的使用目的，载体可以分为克隆载体、表达载体、测序载体、穿梭载体等。
三、体外重组：
体外重组即体外将目的片断和载体分子连接的过程。大多数核酸限制性内切酶能够切割DNA分子形成有黏性末端，用同一种酶或同尾酶切割适当载体的多克隆位点便可获得相同的黏性末端，黏性末端彼此退火，通过T4 DNA连接酶的作用便可形成重组体，此为黏末端连接。
当目的DNA片断为平端，可以直接与带有平端载体相连，此为平末端连接，但连接效率比黏端相连差些。有时为了不同的克隆目的，如将平端DNA分子插入到带有黏末端的表达载体实现表达时，则要将平端DNA分子通过一些修饰；
如同聚物加尾，加衔接物或人工接头，PCR法引入酶切位点等，可以获得相应的黏末端，然后进行连接，此为修饰黏末端连接。
四、导入受体细胞：
载体DNA分子上具有能被原核宿主细胞识别的复制起始位点，因此可以在原核细胞如大肠杆菌中复制，重组载体中的目的基因随同载体一起被扩增，最终获得大量同一的重组DNA分子。
五、重组子的筛选：
从不同的重组DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子即阳性克隆的过程就是筛选。发展起来的成熟筛选方法如下：
（1）插入失活法：外源DNA片段插入到位于筛选标记基因（抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因）的多克隆位点后，会造成标记基因失活，表现出转化子相应的抗生素抗性消失或转化子颜色改变，通过这些可以初步鉴定出转化子是重组子或非重组子。常用的是β-半乳糖苷酶显色法即蓝白筛选法（白色菌落是重组质粒）。
（2）PCR筛选和限制酶酶切法：提取转化子中的重组DNA分子作模板，根据目的基因已知的两端序列设计特异引物，通过PCR技术筛选阳性克隆。PCR法筛选出的阳性克隆，用限制性内切酶酶切法进一步鉴定插入片段的大小。
（3）核酸分子杂交法：制备目的基因特异的核酸探针，通过核酸分子杂交法从众多的转化子中筛选目的克隆。目的基因特异的核酸探针可以是已获得的部分目的基因片段,或目的基因表达蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物种的同源基因。
（4）免疫学筛选法：获得目的基因表达的蛋白抗体，就可以采用免疫学筛选法获得目的基因克隆。这些抗体即可是从生物本身纯化出目的基因表达蛋白抗体，也可从目的基因部分ORF片段克隆在表达载体中获得表达蛋白的抗体。
扩展资料：
基因克隆的注意事项：
1、平端连接：DNA连接酶可催化相同和不同限制性核酸内切酶切割的平端之间的连接。原则上讲，限制酶切割DNA后产生的平端也属配伍末端，可彼此相互连接；若产生的粘性末端经特殊酶处理，使单链突出处被补齐或削平，变为平端，也可实行平端连接。
2、加尾连接：同聚物加尾连接是利用同聚物序列，如多聚A与多聚T之间的退火作用完成连接。在末端转移酶作用下，在DNA片段端制造出粘性末端，而后进行粘性末端连接。这是一种人工提高连接效率的方法，也属于粘性末端连接的一种特殊形式。
3、人工接头连接：对平端DNA片段或载体DNA，可在连接前将磷酸化的接头(linker)或适当分子连到平端，使产生新的限制性内切酶位点。再用识别新位点的限制性内切酶切除接头的远端，产生粘性末端。
参考资料来源：百度百科-基因克隆
参考资料来源：百度百科-DNA克隆
步骤如下：
1、目的DNA片段的获得
DNA克隆的第一步是获得包含目的基因在内的一群DNA分子，这些DNA分子或来自于目的生物基因组DNA或来自目的细胞mRNA逆转录合成的双链 cDNA分子。
由于基因组DNA较大，不利于克隆，因此有必要将其处理成适合克隆的DNA小片段，常用的方法有机械切割和核酸限制性内切酶消化。
若是基因序列已知而且比较小就可用人工化学直接合成。如果基因的两端部分序列已知，根据已知序列设计引物，从基因组DNA 或cDNA中通过PCR技术可以获得目的基因。
2、载体的选择
基因工程的载体应具有一些基本的性质：
（1）在宿主细胞中有独立的复制和表达的能力，这样才能使外源重组的DNA片段得以扩增。
（2）分子量尽可能小，以利于在宿主细胞中有较多的拷贝，便于结合更大的外源DNA片段。同时在实验操作中也不易被机械剪切而破坏。
（3）载体分子中最好具有两个以上的容易检测的遗传标记（如抗药性标记基因），以赋予宿主细胞的不同表型特征（如对抗生素的抗性）。
（4）载体本身最好具有尽可能多的限制酶单一切点，为避开外源DNA片段中限制酶位点的干扰提供更大的选择范围。若载体上的单一酶切位点是位于检测表型的标记基因之内可造成插入失活效应，则更有利于重组子的筛选。
DNA克隆常用的载体有：质粒载），噬菌体载体，柯斯质粒载体，单链DNA噬菌体载体，噬粒载体及酵母人工染色体等。从总体上讲，根据载体的使用目的，载体可以分为克隆载体，表达载体，测序载体，穿梭载体等。
3、体外重组
体外重组即体外将目的片断和载体分子连接的过程。大多数核酸限制性内切酶能够切割DNA分子形成有黏性末端，用同一种酶或同尾酶切割适当载体的多克隆位点便可获得相同的黏性末端，黏性末端彼此退火，通过T4 DNA连接酶的作用便可形成重组体，此为黏末端连接。
当目的DNA片断为平端，可以直接与带有平端载体相连，此为平末端连接，但连接效率比黏端相连差些。
有时为了不同的克隆目的，如将平端DNA分子插入到带有黏末端的表达载体实现表达时，则要将平端DNA分子通过一些修饰，如同聚物加尾，加衔接物或人工接头，PCR法引入酶切位点等，可以获得相应的黏末端，然后进行连接，此为修饰黏末端连接。
4、导入受体细胞
载体DNA分子上具有能被原核宿主细胞识别的复制起始位点，因此可以在原核细胞如大肠杆菌中复制，重组载体中的目的基因随同载体一起被扩增，最终获得大量同一的重组DNA分子。
将外源重组DNA分子导入原核宿主细胞的方法有转化，转染，转导。重组质粒通过转化技术可以导入到宿主细胞中，同样重组噬菌体DNA可以通过转染技术导入。
转染效率不高，因此将重组噬菌体 DNA或柯斯质粒体外包装成有浸染性的噬菌体颗粒，借助这些噬菌体颗粒将重组DNA分子导入到宿主细胞转导技术，这种转导技术的导入效率要比转染的导入效率高。
5、重组子的筛选
从不同的重组DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子即阳性克隆的过程就是筛选。发展起来的成熟筛选方法如下：
（一）插入失活法
外源DNA片段插入到位于筛选标记基因（抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因）的多克隆位点后，会造成标记基因失活，表现出转化子相应的抗生素抗性消失或转化子颜色改变，通过这些可以初步鉴定出转化子是重组子或非重组子。常用的是β-半乳糖苷酶显色法即蓝白筛选法。
（二）PCR筛选和限制酶酶切法
提取转化子中的重组DNA分子作模板，根据目的基因已知的两端序列设计特异引物，通过PCR技术筛选阳性克隆。PCR法筛选出的阳性克隆，用限制性内切酶酶切法进一步鉴定插入片段的大小。
（三）核酸分子杂交法
制备目的基因特异的核酸探针，通过核酸分子杂交法从众多的转化子中筛选目的克隆。目的基因特异的核酸探针可以是已获得的部分目的基因片段,或目的基因表达蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物种的同源基因。
（四）免疫学筛选法
获得目的基因表达的蛋白抗体，就可以采用免疫学筛选法获得目的基因克隆。这些抗体即可是从生物本身纯化出目的基因表达蛋白抗体，也可从目的基因部分ORF片段克隆在表达载体中获得表达蛋白的抗体。
上述方法获得的阳性克隆最后要进行测序分析，以最终确认目的基因。
扩展资料：
历史
基因克隆技术的想法第一次出现在1972年11月在檀香山的一个有关质粒的科学会议上。（质粒是在细菌中发现的DNA环。质粒携带某些对抗生素的耐药性的基因。）一直在研究质粒的史坦利·科恩，对赫伯特·博耶网站上的关于细菌酶切割DNA分子中的特定部分的介绍很感兴趣。
在一个深夜游览威基基的一间熟食店两位科学家相遇并谈到将合作领域的科学知识相结合，构思出了一个开创现代生物技术产业的实验。到1973年初，他们推出了一系列的实验，得到方法来选择特定的外源基因在细菌中复制。
参考资料来源：百度百科-基因克隆
选择目的基因,并设计相应引物；
用引物PCR扩增目的基因片段；
选择合适（抗性标记、酶切位点等）的克隆载体（为了保真扩增）,并将PCR片段连接入克隆载体中；（一般用Taq酶的PCR产物在末尾会自带一个A,可在Solution 1作用下与两端各带一个T的线性T载体直接相连）
将连接产物转化入感受态大肠杆菌,使之在含有抗生素的培养基上生长扩增；
从大肠杆菌中提取质粒（即前面的连接产物）,酶切鉴定和测序鉴定均无误后将目的基因片段切下并与新的表达载体连接,然后再次转化入大肠杆菌中扩增,再提质粒,即得到想要的目的基因片段克隆.
答：基因克隆的基本步骤流程如下：一、目的DNA片段的获得：DNA克隆的第一步是获得包含目的基因在内的一群DNA分子，这些DNA分子或来自于目的生物基因组DNA或来自目的细胞mRNA逆转录合成的双链 cDNA分子。由于基因组DNA较大，不利于克隆，因此有必要将其处理成适合克隆的DNA小片段，常用的方法有机械切割和核酸限制...
答：【答案】：基本过程包括：A．将培养基上得菌落原位转移到滤膜上；B．对滤膜和细胞进行处理，使DNA暴露并变性成单链；C．将同位素探针液加入到滤膜上保温一定时间使之与克隆的目的基因杂交，冲洗滤膜，除去多余的探针分子；D．将滤膜在光学胶片上进行放射自显影；E．根据放射自显影的具体的斑点位置，挑选...
答：基因克隆即重组DNA技术,指在体外对DNA分子按照既定的目的和方案,采用酶学方法将不同来源的DNA分子在体外剪切和重新连接,组装成一个新的DNA分子.在此基础上,将这个DNA分子导入到一定的宿主细胞,使它能够在宿主细胞中扩增,形成大量的子代分子,此过程即称为基因克隆.基因克隆包括四个基本技术环节 ...
答：（4）PCR产物的酶切,我认为PCR产物切得尽可能的充分对克隆很重要,毕竟保护性碱基只有几个.（5）质粒的酶切.虽然质粒的酶切很简单但是却很讲究,决定着克隆的成败.质粒提取我一般都用试剂盒,质粒提取完毕后我会用紫外分光光度法对质粒进行定量测定,根据A260的值计算出质粒的量,然后再进行酶切,一般酶...
答：利用DNA重组技术在大肠杆菌细胞中克隆外源基因的基本过程通常包括以下步骤：DNA提取：从源生物体中提取所需的外源DNA片段，可以通过PCR扩增、酶切等方法获取特定的DNA序列。载体准备：选择适当的载体，常用的是质粒（plasmid）。质粒是环状的DNA分子，可以在细菌细胞中自主复制。将质粒进行线性化处理，通常通过...
答：2. 基因克隆流程 前面了解了基因克隆使用的相关工具酶和载体,接下来,我们介绍基因克隆的实验流程。细分的话,包括以下10个步骤(表6)。 下面我们以lncRNA PVT1的克隆和表达,分别采用T/A克隆,传统酶切-酶连克隆和无缝克隆进行示例。(1) T/A克隆 T/A克隆是把PCR片段与一个具有3’-T突出的载体DNA连接起来的...
答：简单的说一下：扩增目的基因，比如通过PCR的方法。PCR扩增的序列可以通过酶切或者TOPO TA的方法插入到载体质粒。转染大肠杆菌 筛选阳性克隆一般常采用蓝白克隆方法，就是在载体上，序列的插入位置本来是一个完整编码β-gal这个酶的序列，如果不被破坏，产生的酶可以降解细菌培养盘上的底物，形成蓝色产物。
答：基因克隆的方法主要有哪几种 选择目的基因,并设计相应引物；用引物PCR扩增目的基因片段；选择合适（抗性标记、酶切位点等）的克隆载体（为了保真扩增）,并将PCR片段连接入克隆载体中；（一般用Taq酶的PCR产物在末尾会自带一个A,可在Solution 1作用下与两端各带一个T的线性T载体直接相连）将连接产物转化...
答：根据题干的信息：“信使RNA进行基因的克隆（即形成许多完全相同的DNA）”，可知该过程为mRNA逆转录DNADNA复制大量的DNA．因此：信使RNA进行基因的克隆（即形成许多完全相同的DNA），这种快速克隆基因的步骤依次是③逆转录→①DNA复制．故选：C．
答：克隆犬的过程首先面临的是成熟卵母细胞的获取问题。克隆技术涉及三个主要技术环节：首先是成熟卵母细胞的获取和卵母细胞去核；其次是克隆胚胎的制备；最后是克隆胚胎的移植。获取成熟卵母细胞主要有两种方法：一是体外成熟培养，二是体内成熟获取。例如，对于猪、牛、羊等动物，可以在屠宰场从被屠宰动物的...
