玩转单细胞高级分析|单细胞inferCNV分析篇
kuaidi.ping-jia.net 作者：佚名 更新日期：2024-07-05
单细胞测序技术已广泛应用于肿瘤方向的研究，但是受限于肿瘤细胞没有明确的Marker 基因，很难通过转录组数据从肿瘤细胞中区分正常和恶性肿瘤细胞。单细胞拷贝数变异（CNV）分析基于单细胞转录组数据，利用不同样本或不同细胞类型之间的基因表达量预测大规模染色体水平的CNVs，发现拷贝数异常的细胞，从而帮助推断肿瘤恶性细胞，为肿瘤异质性、克隆进化的研究奠定基础。
一、单细胞CNV分析方法
1.inferCNV
inferCNV[1]是由Broad机构开发的比较权威的单细胞CNV分析工具，其分析思路为：在整个基因组范围内，将每个肿瘤细胞基因表达与平均表达或“正常”参考细胞基因表达对比，通过热图的形式展示每条染色体上的基因相对表达量。可以直观看出，相对于正常细胞来讲，肿瘤细胞基因组会发生大规模的过表达或者低表达。
二、单细胞CNV分析应用思路
单细胞CNV预测分析可以推断肿瘤细胞，解析肿瘤细胞异质性，为探索肿瘤克隆进化、挖掘肿瘤发生机制提供参考。
1.区分肿瘤细胞与非恶性细胞
在肿瘤研究中，可以通过CNV预测分析区分肿瘤细胞和非恶性细胞。2018年纽约大学计算医学研究所等单位的研究人员在Nature Biotechnology发表了利用单细胞和空间转录组研究胰腺导管癌（PDAC）异质性的文章。为了区分癌细胞和非恶性导管细胞，该研究对PDAC-A和PDAC-B 2例单细胞数据进行了CNV预测分析。发现PDAC-A中高表达TM4SF1（簇1）和S100A4（簇2）的两个细胞群及PDAC-B中高表达TM4SF1的一个细胞群表现出拷贝数变异特征。通过免疫荧光验证发现PDAC-A中TM4SF1和S100A4在恶性导管细胞中表达，PDAC-B中TM4SF1与恶性细胞标志物KRT19共定位，结合CNV预测结果证实了PDAC样本存在转录不同的肿瘤细胞群。
2.探索肿瘤细胞异质性
在肿瘤研究中，可以通过CNV预测分析探索肿瘤细胞的异质性。2021年德克萨斯大学等单位的研究人员在Nature Medicine发表了利用单细胞转录组研究胃癌晚期腹腔转移病人腹水样本肿瘤细胞异质性的文章。该研究通过对腹水样本的肿瘤细胞进行CNV预测分析，并构建发育树，发现了5个具有不同CNV分布的亚群B1-B5。B5亚群显示结直肠样细胞特征，B2亚群由胃系细胞组成，B1、B3及B4亚群与B2和B5亚群共享部分CNV，揭示了胃癌肿瘤细胞的异质性。
3.揭示肿瘤的克隆进化
在肿瘤研究中，可以通过CNV预测分析探索肿瘤的克隆进化。2020年美国迈阿密大学等单位的研究人员在Nature Communications发表了利用单细胞测序研究葡萄膜黑色素瘤进化复杂性的文章。该研究对8例原发癌和3例转移癌进行单细胞CNV预测分析，发现不同样本间存在显著的拷贝数变异差异，揭示了葡萄膜黑色素瘤潜在的肿瘤间异质性。进一步根据某个CNV在细胞中的占比构建进化树，发现驱动葡萄膜黑色素瘤突变的3条进化轨迹—低度转移肿瘤中的EIF1AX突变、中度转移肿瘤中的SF3B1突变及高度转移肿瘤中的BAP1突变，绘制了葡萄膜黑色素瘤的进化轨迹及发展机制。
参考文献：
1. Anoop P. Patel, Itay Tirosh, et al. Single-cell RNA-seq Highlights Intratumoral Heterogeneity in Primary Glioblastoma[J]. Science, 2014, 344(6190):1396-401.
2. Moncada R, Barkley D, Wagner F, et al. Integrating Microarray-based Spatial Transcriptomics and Single-cell RNA-seq Reveals Tissue Architecture in Pancreatic Ductal Adenocarcinomas[J]. Nature Biotechnology, 2018, 38(3):333-342.
3. Wang R,Dang M, Harada K, et al. Single-cell Dissection of Intratumoral Heterogeneity and Lineage Diversity in Metastatic Gastric Adenocarcinoma[J]. Nature Medicine, 2021, 27(1):141-151.
4. Durante M A, Rodriguez D A, Kurtenbach S, et al. Single-cell Analysis Reveals New Evolutionary Complexity in Uveal Melanoma[J]. Nature Communications, 2020, 11(1):496.
专家经验谈:如何开展单细胞qPCR分析(三)
答：如果避免了预扩增，数据可转换成绝对的cDNA数量，否则数据分析可以Cq值来开展，因为每个细胞的转录本水平呈对数正态分布。一开始，可以各种方法对数据作图，此外，基本的统计分析也应开展（如阳性细胞的数量、平均值和偏差）。细胞数量测定通常是以验证过的参考基因来均一化的。这种策略在单细胞分析中应避免...
【单细胞测序数据分析-1】认识Seurat对象数据结构/数据格式及操作_百 ...
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单细胞专题 | 带你“走近”单细胞转录组测序
答：早期的技术，如SMART-Seq2和流式分选，尽管具有开创性，但成本高昂且技术局限性明显。然而，随着微流控技术的崛起，如10X Genomics Chromium，它显著降低了成本并提高了效率，使得大规模单细胞测序成为了可能。这一技术流程包括捕获、标记、反转录、构建文库、测序，以及后续的详尽数据分析，每一个步骤都...
单细胞之轨迹分析-5:slingshot
答：轨迹分析系列：slingshot 包可以对单细胞RNA-seq数据进行细胞分化谱系构建和伪时间推断。它利用细胞聚类簇和空间降维信息，以无监督或半监督的方式学习细胞聚类群之间的关系，揭示细胞聚类簇之间的全局结构，并将该结构转换为由一维变量表示的平滑谱系，称之为“伪时间”。参考： Seurat对象、SingleCell...
研究思路 | 且看植物叶片单细胞研究套路
答：在单细胞转录组数据分析过程中,主要通过差异分析鉴定出某个细胞亚群的特征性基因,再结合Marker基因鉴定细胞类型。因此,新Marker基因的挖掘有助于深入阐明细胞异质性, 并且对于识别植物发育过程中未知细胞类型的细胞群体是非常关键的。 例如,2020年6月在Molecular Plant期刊上发表的文章[1]中,研究人员以5日龄拟南芥幼苗...
单细胞测序应用及思路解析
答：细胞裂解：将单个细胞进行裂解，释放其中的RNA、DNA等分子。库构建：将RNA、DNA等分子进行逆转录、扩增、建库等处理，构建出单细胞的转录组或基因组文库。测序：将构建好的文库进行高通量测序，产生大量的序列数据。数据分析：对测序数据进行分析，包括数据质量控制、比对、拼接、注释等步骤，得到单个细胞的...
单细胞数据处理小细节汇总
答：单细胞RNA 测序数据中,文库之间测序覆盖率的系统差异通常是由细胞间的cDNA 捕获或PCR 扩增效率方面的技术差异引起的,这归因于用最少的起始材料难以实现一致的文库制备。标准化旨在消除这些差异(例如长度,GC 含量),以使它们不干扰细胞之间表达谱的比较。这样可以确保在细胞群体中观察到的任何异质性或差异表达都是由生物...
生信综述?带你解锁高分单细胞发文骚操作!
答：在这篇综述中，我们对分析管道进行了一个简化的概述，因为它们通常在该领域中使用。我们的目标是使研究人员开始单细胞分析，以获得挑战和最常用的分析工具的概述。此外，我们希望能够帮助其他人了解单细胞数据集的典型读数在已发表的文献中是如何呈现的。好吧，确实是一篇综述！全文虽然有7副图，但大多都...
单细胞研究|| 利用 Illumina®技术的近期单细胞研究文献综述(数据...
答：单细胞研究|| 利用 Illumina®技术的近期单细胞研究文献综述(应用篇一) 主要介绍单细胞技术在癌症、宏基因组学、干细胞、发育生物学、免疫学、神经生物学方面的应用。 单细胞研究|| 利用 Illumina®技术的近期单细胞研究文献综述(应用二) ,主要介绍单细胞技术在药物发现、生殖健康、微生物生态学和进化、植物生物...
单细胞分析之细胞交互-3:CellChat
答：CellChat工作流程图：从Seurat对象直接创建： ⚠️：构建Cell Chat对象时，输入的是log后的数据。在CellChat中，我们还可以先择特定的信息描述细胞间的相互作用，可以理解为从特定的侧面来刻画细胞间相互作用，比用一个大的配体库又精细了许多。对表达数据进行预处理，用于细胞间的通信分析...
一、单细胞CNV分析方法
1.inferCNV
inferCNV[1]是由Broad机构开发的比较权威的单细胞CNV分析工具，其分析思路为：在整个基因组范围内，将每个肿瘤细胞基因表达与平均表达或“正常”参考细胞基因表达对比，通过热图的形式展示每条染色体上的基因相对表达量。可以直观看出，相对于正常细胞来讲，肿瘤细胞基因组会发生大规模的过表达或者低表达。
二、单细胞CNV分析应用思路
单细胞CNV预测分析可以推断肿瘤细胞，解析肿瘤细胞异质性，为探索肿瘤克隆进化、挖掘肿瘤发生机制提供参考。
1.区分肿瘤细胞与非恶性细胞
在肿瘤研究中，可以通过CNV预测分析区分肿瘤细胞和非恶性细胞。2018年纽约大学计算医学研究所等单位的研究人员在Nature Biotechnology发表了利用单细胞和空间转录组研究胰腺导管癌（PDAC）异质性的文章。为了区分癌细胞和非恶性导管细胞，该研究对PDAC-A和PDAC-B 2例单细胞数据进行了CNV预测分析。发现PDAC-A中高表达TM4SF1（簇1）和S100A4（簇2）的两个细胞群及PDAC-B中高表达TM4SF1的一个细胞群表现出拷贝数变异特征。通过免疫荧光验证发现PDAC-A中TM4SF1和S100A4在恶性导管细胞中表达，PDAC-B中TM4SF1与恶性细胞标志物KRT19共定位，结合CNV预测结果证实了PDAC样本存在转录不同的肿瘤细胞群。
2.探索肿瘤细胞异质性
在肿瘤研究中，可以通过CNV预测分析探索肿瘤细胞的异质性。2021年德克萨斯大学等单位的研究人员在Nature Medicine发表了利用单细胞转录组研究胃癌晚期腹腔转移病人腹水样本肿瘤细胞异质性的文章。该研究通过对腹水样本的肿瘤细胞进行CNV预测分析，并构建发育树，发现了5个具有不同CNV分布的亚群B1-B5。B5亚群显示结直肠样细胞特征，B2亚群由胃系细胞组成，B1、B3及B4亚群与B2和B5亚群共享部分CNV，揭示了胃癌肿瘤细胞的异质性。
3.揭示肿瘤的克隆进化
在肿瘤研究中，可以通过CNV预测分析探索肿瘤的克隆进化。2020年美国迈阿密大学等单位的研究人员在Nature Communications发表了利用单细胞测序研究葡萄膜黑色素瘤进化复杂性的文章。该研究对8例原发癌和3例转移癌进行单细胞CNV预测分析，发现不同样本间存在显著的拷贝数变异差异，揭示了葡萄膜黑色素瘤潜在的肿瘤间异质性。进一步根据某个CNV在细胞中的占比构建进化树，发现驱动葡萄膜黑色素瘤突变的3条进化轨迹—低度转移肿瘤中的EIF1AX突变、中度转移肿瘤中的SF3B1突变及高度转移肿瘤中的BAP1突变，绘制了葡萄膜黑色素瘤的进化轨迹及发展机制。
参考文献：
1. Anoop P. Patel, Itay Tirosh, et al. Single-cell RNA-seq Highlights Intratumoral Heterogeneity in Primary Glioblastoma[J]. Science, 2014, 344(6190):1396-401.
2. Moncada R, Barkley D, Wagner F, et al. Integrating Microarray-based Spatial Transcriptomics and Single-cell RNA-seq Reveals Tissue Architecture in Pancreatic Ductal Adenocarcinomas[J]. Nature Biotechnology, 2018, 38(3):333-342.
3. Wang R,Dang M, Harada K, et al. Single-cell Dissection of Intratumoral Heterogeneity and Lineage Diversity in Metastatic Gastric Adenocarcinoma[J]. Nature Medicine, 2021, 27(1):141-151.
4. Durante M A, Rodriguez D A, Kurtenbach S, et al. Single-cell Analysis Reveals New Evolutionary Complexity in Uveal Melanoma[J]. Nature Communications, 2020, 11(1):496.
答：如果避免了预扩增，数据可转换成绝对的cDNA数量，否则数据分析可以Cq值来开展，因为每个细胞的转录本水平呈对数正态分布。一开始，可以各种方法对数据作图，此外，基本的统计分析也应开展（如阳性细胞的数量、平均值和偏差）。细胞数量测定通常是以验证过的参考基因来均一化的。这种策略在单细胞分析中应避免...
答：一文了解单细胞对象数据结构/数据格式，单细胞数据操作不迷茫。本文内容包括 单细胞seurat对象数据结构， 内容构成，对象的调用、操作，常见函数的应用等。默认情况下，我们是对Seurat中的RNA的Assay进行操作。可以通过 @active.assay 查看当前默认的assay，通过 DefaultAssay() 更改当前的默认assay。 结构 ...
答：早期的技术，如SMART-Seq2和流式分选，尽管具有开创性，但成本高昂且技术局限性明显。然而，随着微流控技术的崛起，如10X Genomics Chromium，它显著降低了成本并提高了效率，使得大规模单细胞测序成为了可能。这一技术流程包括捕获、标记、反转录、构建文库、测序，以及后续的详尽数据分析，每一个步骤都...
答：轨迹分析系列：slingshot 包可以对单细胞RNA-seq数据进行细胞分化谱系构建和伪时间推断。它利用细胞聚类簇和空间降维信息，以无监督或半监督的方式学习细胞聚类群之间的关系，揭示细胞聚类簇之间的全局结构，并将该结构转换为由一维变量表示的平滑谱系，称之为“伪时间”。参考： Seurat对象、SingleCell...
答：在单细胞转录组数据分析过程中,主要通过差异分析鉴定出某个细胞亚群的特征性基因,再结合Marker基因鉴定细胞类型。因此,新Marker基因的挖掘有助于深入阐明细胞异质性, 并且对于识别植物发育过程中未知细胞类型的细胞群体是非常关键的。 例如,2020年6月在Molecular Plant期刊上发表的文章[1]中,研究人员以5日龄拟南芥幼苗...
答：细胞裂解：将单个细胞进行裂解，释放其中的RNA、DNA等分子。库构建：将RNA、DNA等分子进行逆转录、扩增、建库等处理，构建出单细胞的转录组或基因组文库。测序：将构建好的文库进行高通量测序，产生大量的序列数据。数据分析：对测序数据进行分析，包括数据质量控制、比对、拼接、注释等步骤，得到单个细胞的...
答：单细胞RNA 测序数据中,文库之间测序覆盖率的系统差异通常是由细胞间的cDNA 捕获或PCR 扩增效率方面的技术差异引起的,这归因于用最少的起始材料难以实现一致的文库制备。标准化旨在消除这些差异(例如长度,GC 含量),以使它们不干扰细胞之间表达谱的比较。这样可以确保在细胞群体中观察到的任何异质性或差异表达都是由生物...
答：在这篇综述中，我们对分析管道进行了一个简化的概述，因为它们通常在该领域中使用。我们的目标是使研究人员开始单细胞分析，以获得挑战和最常用的分析工具的概述。此外，我们希望能够帮助其他人了解单细胞数据集的典型读数在已发表的文献中是如何呈现的。好吧，确实是一篇综述！全文虽然有7副图，但大多都...
答：单细胞研究|| 利用 Illumina®技术的近期单细胞研究文献综述(应用篇一) 主要介绍单细胞技术在癌症、宏基因组学、干细胞、发育生物学、免疫学、神经生物学方面的应用。 单细胞研究|| 利用 Illumina®技术的近期单细胞研究文献综述(应用二) ,主要介绍单细胞技术在药物发现、生殖健康、微生物生态学和进化、植物生物...
答：CellChat工作流程图：从Seurat对象直接创建： ⚠️：构建Cell Chat对象时，输入的是log后的数据。在CellChat中，我们还可以先择特定的信息描述细胞间的相互作用，可以理解为从特定的侧面来刻画细胞间相互作用，比用一个大的配体库又精细了许多。对表达数据进行预处理，用于细胞间的通信分析...
