紫外线诱变育种的基本原理和主要步骤
一、实验目的和内容目的：以紫外线诱变获得用于酱油生产的高产蛋白酶菌株为例，学习微生物诱变育种的基本操作方法。内容：1．对米曲霉(Aspergillsoryzae)出发菌株进行处理，制备孢子悬液。2．用紫外线进行诱变处理。3．用平板透明圈法进行两次初筛。4．用摇瓶法进行复筛及酶活性测定。二、实验材料和用具米曲霉斜面菌种；豆饼斜面培养基、酪素培养基、蒸馏水、0.5%酪蛋白；三角瓶(300mL、500mL)、试管、培养皿(9cm)、恒温摇床、恒温培养箱、紫外照射箱、磁力搅拌器、脱脂棉、无菌漏斗、玻璃珠、移液管、涂布器、酒精灯。三、操作步骤(一)出发菌株的选择及菌悬液制备1．出发菌株的选择可直接选用生产酱油的米曲霉菌株，或选用高产蛋白酶的米曲霉菌株。2.菌悬液制备取出发菌株转接至豆饼斜面培养基中，30℃培养3～5d活化。然后孢子洗至装有1mL0.lmol/LpH6.0的无菌磷酸缓冲液的三角瓶中(内装玻璃珠，装量以大致铺满瓶底为宜)，30℃振荡30min，用垫有脱脂棉的灭菌漏斗过滤，制成把子悬液，调其浓度为106～108个/mL，冷冻保藏备用。(二)诱变处理用物理方法或化学方法，所用诱变剂种类及剂量的选择可视具体情况决定，有时还可采用复合处理，可获得更好的结果。本实验学习用紫外线照射的诱变方法。1．紫外线处理打开紫外灯(30W)预热20min。取5mL菌悬液放在无菌的培养皿(9cm)中，同时制作5份。逐一操作，将培养皿平放在离紫外灯30cm(垂直距离)处的磁力搅拌器上，照射lmin后打开培养皿盖，开始照射，与照射处理开始的同时打开磁力搅拌器进行搅拌，即时计算时间，照射时间分别为15s、30s、lmin、2min、5min。照射后，诱变菌液在黑暗冷冻中保存1～2h然后在红灯下稀释涂菌进行初筛。2．稀释菌悬液按10倍稀释至10-6，从10-5和10-6中各取出0.lmL加入到酪素培养基平板中(每个稀释度均做3个重复)，然后涂菌并静置，待菌液渗入培养基后倒置，于30℃恒温培养2～3d。(三)优良菌株的筛选1.初筛首先观察在菌落周围出现的透明圈大小，并测量其菌落直径与透明圈直径之比，选择其比值大且菌落直径也大的菌落40～50个，作为复筛菌株。2．平板复筛分别倒酪素培养基平板，在每个平皿的背面用红笔划线分区，从圆心划线至周边分成8等份，1～7份中点种初筛菌株，第8份点种原始菌株，作为对照。培养48h后即可见生长，若出现明显的透明圈，即可按初筛方法检测，获得数株二次优良菌株，进大摇瓶复筛阶段。3．摇瓶复筛将初筛出的菌株，接入米曲霉复筛培养基中进行培养，其方法是，称取麦秩85g，豆饼粉(或面粉)15g，加水95～110mL(称为润水)，水含量以手捏后指缝有水而不下滴为宜，于500mL三角瓶中装入15～20g(料厚为1～1.5cm)，121℃湿热灭菌30min，然后分别接入以上初筛获得的优良菌株，30℃培养，24h后摇瓶一次并均匀铺开，再培养24～48h，共培养3～5d后检测蛋白酶活性。4．蛋白酶的测定方法(1)取样：培养后随机称取以上摇瓶培养物1g，加蒸馏水100mL，(或200mL),40℃水浴，浸酶1h，取上清浸液测定酶活性。另取lg培养物于105℃烘干测定含水量。(2)酶活性测定：30℃pH7.5条件下水解酪蛋白(底物为0.5%酪蛋白)，每分钟产酪氨酸1μg为一个酶活力单位。计算公式为：(A样品OD680nm值-A对照OD680nm值)×K×V/t×NK：标准曲线中光吸收为“1”时的酪氨酸微克数；V：酶促反应的总体积；t：酶促反应时间(min)；N：酶的稀释倍数。5．谷氨酸的检测此项检测也是酱油优良菌株的重要指标之一。检测培养基：豆饼粉：麸夫=6：4，润水75%，121℃湿热灭菌30min。谷氨酸测定：于以上培养基中加入7%盐水(W/V)，40～45℃水浴，水解9d后过滤，以滤液检测谷氨酸含量(测压法)。四、注意事项1.紫外线照射时注意保护眼睛和皮肤。2.诱变过程及诱变后的稀释操作均在红灯下进行，并在黑暗中培养。五、实验报告1.试列表说明高产蛋白酶菌株的筛选过程和结果。2.你认为以上的筛选方法有什么优缺点，如何改进？六、问题和思考1．试述紫外线诱变的作用机理及其在具体操作中应注意的问题。2．为什么在诱变前要把菌悬液打散和培养一段时间？注：筛选菌株数的计算若按突变率为0.01计算，则一次筛选可取250—300个菌落，第一次筛选后可多选几株高产株，而二级筛选为重点阶段，其最适量可参考以下计算方法：如初筛菌株数为200株，二次筛选欲选株数为2株，则二级应选(200×2)1/2，为20株，这样的数量选择，使有可能从较少的数量中获得相对较多的优良菌株。
紫外线诱变处理的有效波长为200~300×10nm，最适为254nm(此为核酸的吸收高峰)。dna和rna的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后，dna分子形成嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体出现会减弱双键间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡.另外二聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响dna的复制和转录.总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失，即是所谓的诱变。
诱变在暗箱中进行。先将一定数量的种子用紫外线照射一段时间，然后再将种子培育出来，观察种子生长状况，发现产生了需要的性状后将该植株保留。注意：前期进行诱变的种子数量一定要多，因为种子发生突变的概率很小。
主要步骤：
1．将细菌培养液以3000r／min离心5min，倾去上清液，将菌体打散加入无菌生理盐水再离心洗涤。
2．将菌悬液放入一已灭菌的，装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动，以打散菌体。将菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液装入试管内，一般处于浑浊态的细胞液含细胞数达
108个／ml左右，作为待处理菌悬液。
3．取2～4mL制备的菌液加到直径9cm培养皿内，放入一无菌磁力搅拌子，然后置磁力拌器上、15W紫外线下30cm处。在正式照射前，应先开紫外线10min，让紫外灯预热，然后开启皿盖正式在搅拌下照射10～50s。操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白
炽光。
4．取未照射的制备菌液和照射菌液各0.5ml进行稀释分离，计数活菌细胞数。
5．取照射菌液2ml于液体培养基中(300ml三角瓶内装30ml培养液)，120r／min振荡培养
4～6h。
6．取中间培养液稀释分离、培养。
答：诱变育种的方法有物理诱变和化学诱变。一、物理诱变 1、物理诱变因素的辐射能对植物诱发化学反应，结果造成DNA结构的变化。这些变化如果在DNA中保持重复，证明是突变。2、物理诱变剂 （1）紫外灯发出的紫外线（UV）照射：紫外线的能量和穿透力低，能成功地用于处理花粉粒。（2）电磁辐射：x射线又称阴极...
答：诱变育种的基本原理是基因突变，主要包括染色体畸变和基因突变。诱变育种是利用各种被称为诱变剂的物理因素和化学试剂处理微生物细胞，提高基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需要的高产优质菌种的育种方法。诱变育种存在的主要问题是有益突变频率仍然较低，变异的方向和性质尚难控制。因此提高诱变效率，...
答：1. 紫外线照射时注意保护眼睛和皮肤。2. 诱变过程及诱变后的稀释操作均在红灯下进行，并在黑暗中培养。五、实验报告 1. 试列表说明高产蛋白酶菌株的筛选过程和结果。2. 你认为以上的筛选方法有什么优缺点，如何改进？六、问题和思考 1．试述紫外线诱变的作用机理及其在具体操作中应注意的问题。2．...
答：1 配制含纤维素的培养基 2 接种细菌 3 诱变处理：如紫外线照射 4 观察透明圈大小，选出菌株 原理：纤维素被纤维素酶水解后变得透明
答：因为它的工作步骤多，具体步骤如下：1、选择适合的植物品种在进行紫外线育种之前，我们需要选择适合的植物品种，一般来说，我们会选择那些具有较高遗传变异性的品种，这样可以增加诱变成功的概率。2、紫外线辐射处理在进行紫外线育种之前，我们需要将植物种子或幼苗暴露在紫外线辐射下，这个过程需要在特定的...
答：诱导变异就是在物理或化学因子的作用下，遗传信息发生变化。如：多造紫外线导致皮肤癌的发生，就是因为紫外线使少数新的皮肤细胞发生了基因突变。多吸烟导致肺癌的发生，其中起作用的是烟焦油等化学因子。楼上回答的诱变育种（诱导变异育种）是诱导变异的一个方面。
答：2、诱变育种 （1）诱变育种的含义是用物理诱变剂、化学诱变剂来处理分散均匀的微生物细胞群，使突变率能够提高，随后再采取方便、快速高效率的筛选方法，挑选出部分符合目的的突变株，从而可供研究。（2）常用的物理诱变剂主要有紫外线、快中子等种类，而常用的化学诱变剂主要有噬菌体。3、杂交育种 （1...
答：2.诱变剂量的选择 选择最适诱变剂量，也就是在提高突变率的基础上，即能扩大变异幅度，又能使变异向正向突变范围移动的剂量。研究方向正向突变多出现在偏低剂量中，形态变异多发生在偏高剂量中，而一般形态变异多趋向于降低产量。3.诱变处理方法的选择 （1）紫外线与光复活的交替处理 能使紫外线诱变...
答：紫外线是一种最常用有效的物理诱变因素，其诱变效应主要是由于它引起DNA结构的改变而形成突变型。紫外线诱变，一般采用15W或30W紫外线灯，照射距离为20-30cm，照射时间依菌种而异，一般为1-3min，死亡率控制在50％-80％为宜。被照射处理的细胞，必须呈均匀分散的单细胞悬浮液状态，以利于均匀接触诱变剂...
答：简单地说，这都属于辐射，应该算是非电离辐射。辐射剂量事宜的情况下，会改变微生物遗传信息载体——染色体的结构，比如强紫外会使细菌T碱基形成胸腺嘧啶二聚体，染色体结构的细微变化即可影响蛋白质的翻译，从而通过蛋白这一生物功能载体表现出生物外在表现性状的变化。从而使得诱变成功进行。
