菌种鉴定常用的分离方法有哪些？
首先你要确定待鉴定的菌种一定是纯种 。如果菌种不纯，所观察到的现象则是混合现象，这样自然不会得到正确的结果。因此在鉴定之前，首先要将菌种纯化。 纯化方法，一般有2种：平板划线单菌落分离法和单细胞分离法。前一种操作简便，效果良好，适用范围广。
菌种鉴定的方法一般有常规鉴定和分子生物学方法：
（1）常规鉴定：菌落形态观察、革兰氏染色、菌毛染色、糖类分解实验、吲哚实验、淀粉水解实验、V-P实验、甲基红实验、柠檬酸盐利用实验、硝酸盐还原实验、接触酶实验等
（2）分子生物学方法：细菌16SrDNA菌种鉴定：提取DNA，特定引物PCR扩增，PCR产物纯化测序，进化树分析；真菌18S rDNA/ITS菌种鉴定流程也是一样的。
菌种鉴定分生理生化鉴定及基因鉴定
生理生化鉴定只是初步鉴定，一般通过镜检及培养基培养，通过表观现象确定菌属，但不能作为未知菌的最终判定手段。
基因鉴定是比较可信的，一般为16s 或18s rdna 鉴定，通过该段特异性目的基因，与genebank上的已知序列对比，判定未知菌种的菌属。该方法中所需要的材料一般为分子生物学材料及设备，方法就是，提取目的基因，与克隆载体链接，转入表达载体，选择阳性克隆，测序，在genebank对比。
菌种质量检测的目标包括菌丝形态、菌落特征以及子实体形态等方面。质量检测常用方法如下：
（1）建立标准的培养和观察方法
对于一个栽培品种各菌种的质量检测，实际上是以该品种典型的生物学特性（包括形态特征、生理生态特性、栽培习性）为参照标准进行比较，以检验菌种是否存在品种退化、菌种老化、病菌侵染、杂菌污染和品种混杂等质量问题。同时，菌种质量检测不仅要考虑从哪些方面来评价一个菌种的质量优劣，也要考虑用怎样的标准方法对菌种质量进行评价的问题。因为一定的结果来源于一定的方法和一定的条件。方法和条件不同，结果就失去了可比性，也就无法鉴别，因此，需要建立标准。这些标准包括：培养基、培养条件（温度、湿度、pH、光照等）、菌种的菌龄等。
（2）连续观察
在菌种生长过程中，要连续观察，一切不正常的现象只有在生长过程中才能表现出来。而当菌种长满培养基表面后，其不正常现象往往会被菌种的过龄而掩盖。
（3）宏观检查
对食用菌母种、原种及栽培种的宏观检查要根据其培养特征来进行（参见前述有关内容），这是菌种生产者及使用者普遍使用的方法，简单易行，但需要有多年的从业经验与技术沉淀。如被检菌种表现出菌落生长速度不一致、气生菌丝变稀疏或出现扇变菌落、菌落上过早出现色素、或不同特征的菌落混杂共存、或菌落上出现黑褐色、青灰色、黄褐色或红色的孢子堆，均可以确定该菌种存在质量问题。优质菌种外观菌丝洁白、密集粗壮，生长速度一致，齐发并进。
在生产实践中，广大菇农和专业工作人员总结出“纯、正、壮、润、香”的质量检查方法。这种应用感官识别菌种优劣，是经验的总结，能大致、快速地鉴定出菌种的优劣。具体方法是：
“纯”指菌种的纯度高，无杂菌感染，无斑块、无抑制线，无“退菌”、“断菌”现象等。
“正”指菌丝无异常，具有亲本正宗的特征，如菌丝纯白、有光泽，生长整齐，连结成块，具弹性等。
“壮”指菌丝发育粗壮，长势旺盛，分枝多而密，在培养基上恢复、定植、蔓延速度快。
“润”指菌种含水量适中，基质湿润，与瓶壁紧贴，瓶颈略有水珠，无干缩、松散现象。
“香”指具该品种特有的香味，无霉变、腥臭、酸败气味。
通过检测各种食用菌菌丝生长的色泽、速度、均匀度等特征是否正常，来判断菌种生长是否正常、是否可用，但辨别不了是否优质高产。
（4）显微镜检查
对菌丝体进行显微观察，可以确定菌丝粗细、分枝、隔膜、锁状联合等特性是否均一，是否与该栽培品种的典型特征一致（参见前述相关内容）。具有不同形态特征的菌丝体存在于同一菌种体中，表明该菌种存在质量问题；如果出现菌丝体重寄生现象，常表现出不同特征的菌丝体相互缠绕，或菌丝体中空变细，或在寄生点出现吸器等不正常现象。
镜检的方法是：挑取少量菌丝，置载玻片中央的水滴上，用解剖针或接种针拨散，盖上盖玻片，也可加碘酒或美蓝等染色后进行镜检。正常的菌丝一般透明、分枝状，有横隔和明显的锁状联合；异宗结合的食用菌，如仅有单核菌丝，不具结实性，不宜作菌种用；双核菌丝中，锁状联合多而密，则结菇力强，一般可认为是好菌种。如：
①双孢菇 观察双孢菇单孢子萌发后的菌丝生长形态。凡菌丝洁白、健壮，保存时间较长时菌丝颜色不变，较耐28℃以上气温，生长在基质上平贴培养基表面，气生菌丝不多的，为同化能力较强，产量较高的菌株。相反，菌丝生长初期好，很快变黄变稀，如蜘蛛丝一样，长出培养基表面菌丝较多的菌株产量较低。
②香菇 观察香菇的双核菌丝，在斜面培养基上生长速度达到1.2厘米/天以上的，菌丝不十分粗壮和洁白，锁状连合频繁，锁状连合在菌丝间相距较近，且在观察面上分布均匀，一般均是高产和抗杂能力较强的菌株。香菇出菇的密度与锁状连合有一定关系。
③草菇 观察草菇菌丝，发现菌丝分枝角度大的，出菇率高，产量高。菌丝分枝角度小、平行排列的，产量低。
各种食用菌的菌丝生长是否正常、是否可用，一般都以色泽、速度、均匀度等特征加以检测，但这并不能说明其是否优质高产。
（5）拮抗试验
也称对峙反应。同一种食用菌，经分离或杂交，将选育出许多不同的菌株，这些菌株的菌丝在形态上很难区别。如不同编号的香菇菌种，都是白色绒毛状菌丝，镜检时均具有锁状联合等。在当前菌种管理工作尚不十分健全的情况下，“同名异种”、“同种异名”的现象普遍发生，要识别异同，可采用“拮抗试验”加以区别。具体方法是：
用1支20毫米×200毫米的无底试管，中央部位装入长 5～7厘米的木屑麸糠培养基，两端压平并盖棉塞，灭菌后，两端各接入两株受检的菌种 1小块，25℃左右条件下培养，当两端菌丝往中央生长并相互接触后，把试管移至20℃、约300勒克斯的漫射光下继续培养，观察菌丝接触区有无对峙反应。若无褐色的带线出现，表示两个受检菌株的基因极相似或相同，是相同的菌株，仅编号不同，即同种异名。如果受检菌株间形成带线，则表示是不同的菌株。
用平板进行拮抗试验测试，方法是在无菌的PDA培养基平板上各接入2个或多个被检菌株的菌种，在上述条件下培养，观察菌丝相接触部分有无带线，以区别相同或不同的菌株。也可用菌种瓶（袋）进行拮抗测试（图2-11）。
图2-11 拮抗现象
（6）菌丝长速测定
在适宜的条件下，若菌丝生长迅速、粗壮有力、浓密整齐，一般为优质菌种。若菌丝生长缓慢、中断或长速极快、稀疏无力、参差不齐和易枯黄萎缩，则为不良菌种。菌丝生长速度测定，可在PDA平板中心接种培养，测量菌落两个直交直径，取其平均值。同理，还可在原种、栽培种瓶（袋）壁上划线测定。
（7）菌丝生长量测定
将等面积的菌苔接入无菌的液体培养基内，在相同的条件下，进行摇床振动培养，经过一定时间后，过滤收集菌丝，反复冲洗干净后置容器内，80～100℃烘箱中烘干至恒重后称重。凡菌丝增殖快、重量重的为优质菌株，而增殖慢、重量轻的为不良菌株。
（8）耐高温测定
以双孢菇为例，把菌种置于20～22℃下培养，待菌丝长到1/2试管斜面时，每一菌株取出2～3支试管，置于35℃温度下，经24小时作抗热性试验，然后放到22～23℃下培养，观察菌丝恢复情况。若菌丝恢复萌发快，仍健壮、旺盛生长，则表明该菌株具有耐较高温的优良性状；如果菌丝生长缓慢，出现发黄倒伏，萎缩无力，则为不良菌株。
（9）均一性测定
将母种接种于标准培养基的平板上，并置于标准的环境条件下，每批做30～50个重复，进行长势和长速的连续观察记录。均一性好的品种，每个重复之间长势和长速几乎没有肉眼可见的差异。如果长势和长速不一，则表明原始的母种的遗传均一性不良，不宜作生产用种。
（10）纯度测定
菌种纯度高低是鉴定菌种质量好坏的关键环节。优质菌种要求同一管、瓶或袋内只含有所需要的菌种菌丝体，而不能含有其他种类的杂菌。这里所说的杂菌包括细菌、放线菌、酵母菌和各种霉菌，以及含有两种食用菌菌丝体或同一种食用菌的两个品种菌丝。凡是被杂菌污染的菌种都是不纯菌种，必须予以淘汰。在三角瓶内装入浅层液体培养基，灭菌后接入经捣散的菌种，25℃条件下培养，约1周观察，若有气泡和菌膜发生，并具酸败味，说明菌种不纯，混有杂菌；如果无上述现象则菌种纯正无杂。
（11）长势测定
菌丝长势包括菌丝生长的状态和速度。凡是菌丝生长迅速、整齐浓密、健壮有力的菌种为优良菌种。如果菌丝生长缓慢，或长速特快、稀疏无力、参差不齐、易于衰老，则表明是劣质菌种。在鉴别菌丝长势时，必须注意，在不同培养基上、不同培养条件下，同一种食用菌菌丝的长势不同，因此，判断食用菌的菌种长势，应采用相同的培养基，这样，结果就可靠一些。在外界环境条件相同的情况下，菌丝生长旺盛、生长量多、生长速度快的要好于菌丝生长弱、生长量少、生长速度慢的菌种。还有一种方法是在三角瓶内装入浅层液体培养基，灭菌后接入经捣散的菌种，25℃条件下培养，约1周观察浮在液面的菌种。如果菌丝向旁边迅速生长、健壮有力、边缘整齐，且不断增厚，说明该菌株生长势强；若表面生长慢、稀疏、菌丝层薄，说明长势弱，不宜用于生产。
（12）抗霉性测定
以木耳为例：制备平板，在平板的一边分别接入不同的木耳菌株，每一菌株3个重复，在26～28℃下培养。待木耳菌丝长到平板一半左右时，在平板的另一边接上木霉菌丝，继续培养。之后注意观察木霉菌丝与木耳菌丝的交界处，出现拮抗线的表示木耳菌株抗霉能力强，木霉菌丝无法长过去，为抗霉能力强的菌株。如果木霉菌丝很快盖过木耳菌丝，说明这个木耳菌株的抗霉能力差或没有抗霉力。
（13）出菇试验
对引进或分离的同一品种的若干菌株进行出菇对比试验，必须是在各级菌种的培养基成分、培养温度、培养时间及栽培条件基本一致的情况下进行。出菇试验可按菇类的常规栽培方法进行，数量可少些。为使试验准确，每一菌株设3～4个重复，以避免试验的偶然性。在位置排放上尽可能按菌名拉丁文排列，以相同的措施管理，在管理过程中对环境因子的变化、管理措施及生长历程、品种本身性状等要详细全面记录。以香菇为例记载内容如下：
①母种菌丝生长情况，如菌丝浓淡、生长快慢、菌苔韧性等。
②原种、栽培种中菌丝生长情况，如菌丝萌动、吃料、生长快慢；菌种表面有无菌皮或菌皮厚薄，白色颗粒状物有无或多少；培养基转色情况等。
③栽培阶段应记载：菇木转色快慢、颜色深浅；出菇快慢、菇生长密度；子实体经济性状，包括菇的大小、厚度、色泽、圆整程度、菌柄长度、粗细等；转潮快慢；对水分的敏感程度；产量及产量分布；出口菇比例等。
通过对记载资料分析，选出综合性状符合要求的菌株，供大面积生产或出售。
出菇试验因季节推迟或其他原因，可采用一种较简单的方法来弥补，即直接将接有各菌株并已发好菌的瓶（袋）装菌种，小心地敲破瓶颈或打开塑料袋口，使培养料外露（如果是双孢菇，则要覆土调好土粒的湿度），置最适宜的温、湿度条件下进行出菇（耳）管理，观察记载各项指标，最后进行评比。但这种方法的结果只能提供参考。
（14）栽培指标
采用一定的栽培规模，通过不同地区、不同原料、不同栽培方式，进行多次反复栽培观察，详细记录、评比后，具有优质、高产、高抗、高效和遗传性、稳定性强的菌株，才是优质和可推广的品种。其鉴定的内容、方法和指标有：
①吃料能力鉴定 将菌种接入最佳配方的原种培养料中，置适宜的温、湿度条件下培养，1周后观察种菇（耳）菌丝的生长情况。如果菌种块能很快萌发，并迅速向四周和培养料中生长伸展，则说明该品种的吃料能力强；反之，菌种块萌发后生长缓慢，迟迟不向四周的料层深处伸展，则表明该品种对培养料的适应能力差。对菌种吃料能力的测定，不仅用于对菌种本身的考核，同时还可以作为对培养料选择的一种手段。
②成活率 将菌种接在适宜的培养基上，若菌丝能很快恢复、定植和蔓延生长，成活率很高，是质量好的菌种；反之，接种后恢复慢，成活率不高是质量差的菌种。
③出菇快慢 一般说，高温型的出菇快，低温型的出菇慢，中温型的介于两者之间。而以菇的质量来说，高温型的质量差，低温型的质量好。但同一温型食用菌品种的不同菌株，其菌种接种后若菌丝分解培养料能力强，培养前后培养料失重大，出菇快而多，总产高，即是好菌种；否则为劣质菌种。
④菇峰间隔 在一个生产周期中，子实体发生可分数潮次，产菇最多时称菇峰，最低时称菇谷，每个菇峰和菇谷构成一潮菇。凡菇潮多，间隔时间短，说明菌丝分解能力强，供子实体发生的养分积累多，因此转潮快，是好的菌种；反之，菇潮间隔时间长，或不明显，零星出菇，产量低，即为劣质菌种。
⑤干燥率 鲜菇经干制后干燥率高，说明转化率高，子实体含水分低，为优质菌种。
⑥生物学效率 生物学效率，指每100千克干料可产多少千克鲜菇。生物学效率高，则菌种质量好，反之为劣质菌种。
（15）经济指标
高产不一定高效、丰产不等于丰收，要占领市场，获得较高利润，还必须具备商品的要求，如产品的色、香、味、形，档次，上市时间，货架期和保质期等。凡是鲜菇上市时间早，产量高、品质好、档次高、含水量低，不易变色、变质、破碎、失重，无农药残毒、残臭，符合食品卫生标准和得到的利润高等，均表示经济指标高，则为优质菌株；而上市有效时间短，易变色、变味、变质，含水量高，失水严重，易破碎，利润低的菌种均为劣质菌种。如香菇以大小适中、肉厚、色深、边缘内卷，柄短细为优良；双孢菇以色白、子实体大小适中，菌柄短，不易开伞等为优良；银耳以色白、开片好、蒂头小、松泡率高为优良等。
【北纳生物】菌种鉴定常采用以下分离方法：
子实体分离：种菇要选朵大盖厚，柄短，八九分成熟的优良品种。切去菇两基部，在无菌箱内以0.1％的升汞水浸几分钟，再用无菌水冲洗并揩干或用75％酒精棉球擦拭菌盖与菌柄2次，进行表面消毒。接种时，只要将种菇撕开，在萌盖和菌柄交界处或菌褶处，挑取一小块组织；移接 到PDA培养基上。置25℃左右温度下培养3-5天，就可以看到组织上产生白色绒毛状菌丝，转管扩大即得到菌种。如香菇、平菇等可以用此方法。
食用菌生产所用的菌种，是提供繁殖而分级制作的菌丝体培养物，相当于高等植物的种子。在自然界中，食用菌繁衍后代依靠孢子，孢子在适宜的环境下，萌发成菌丝体。菌丝体生长繁衍达到生理成熟后，在适宜的环境下，就可形成子实体。在人工栽培食用菌时，孢子虽然是它的种子，但人们至今都不用孢子直接播种，而是用孢子或子实体组织萌发而成的纯菌丝体作为播种材料。因此，通常所指的菌种，实际上是经过人工培养并进一步繁殖的食用菌的纯菌丝体。
菌核分离：茯苓、猪苓、雷丸等菌的子实体不易采集。而常见的是它贮藏营养的菌核。用菌核分离，同样可以获得菌种。方法是将菌核表面洗净，用酒精或升汞消毒后，切开菌核，取中间组织一小块，约黄豆大小，接种在PDA 培养基斜面上，保温培养。
最常用的两种方法：
1．平板划线分离法
把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基，通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种
优点：可以观察菌落特征，对混合菌进行分离。
缺点：不能计数，一般用于从菌种的分离纯化。
例如：筛选大肠杆菌菌种。
2．稀释涂布平板法
将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。
优点：可以计数，可以观察菌落特征。
缺点：吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延。一般用于平板培养基的回收率计数。
例如：测定纯净水中大肠杆菌的含量。
菌种分离可以分为孢子分离、组织分离和基内菌丝分离三种。
答：其原因是由于单孢子是不出菇的，在多孢菌落中，不亲和、不交配和不孕菌丝大量存在，并与结实性菌丝交织混杂，挑选菌丝时的盲目性和风险性很大，常有栽培后不出菇或出菇率下降等现象。解决这一现象的方法有二：一是做好尖端菌丝的反复提纯工作；二是进行多次出菇鉴定。采用组织分离得到的菌种，虽然成功...
答：用改良的schaeffer-fulton染色法，方法如下：1 取一支洁净的小试管，分别加入2-3滴无菌水，再往一管中加入1—2接种环的菌苔，制成浓的菌悬液。2 在菌悬液中分别加入2-3滴孔雀绿溶液，充分混合后，于沸水浴中加热染色15-20分钟，3 用接种环取试管底部菌液于载玻片上，涂薄，过火焰3次温热固定，...
答：植物病原真菌的分离方法主要有两种：组织分离法和稀释分离法。组织分离法是最常用的方法.稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。植物病原真菌的组织分离的技术与步骤：1）选取典型的病组织，在病健交界处将其剪成5mm×5mm的小方块若干，装于火焰灭菌的小碟中。注: 选择新患病的组织作为...
答：目前最常用的是复性速率法，同一菌的复性率为100%；80%～90%的同源为同一种内同一亚种的细菌；60%～70%同源性为同一种内不同亚种的细菌；20%～60%同源则是同一属中的不同菌种。这种方法还可对新菌种或表型性状差别很小而难以肯定的菌株做出较可靠的判定，并可修正其他方法的分类和鉴定错误。(3)...
答：2018-03-23 菌种鉴定常用的分离方法有哪些? 3 2009-09-13 微生物的菌种鉴定方法与步骤(鉴定到“株”一级) 21 2019-03-28 微生物的菌种鉴定方法与步骤(鉴定到“株”一级) 4 2018-08-12 16SrRNA鉴定菌株的方法!求详细步骤! 6 2017-07-20 菌种生产性能鉴定中复筛的方法 1 更多...
答：若未发现杂菌和异常现象，再把菌种接在木段上，做周期产量鉴定。如果子实体生长旺盛，高产优质，具备优良品种特性，并且没有杂菌混生，说明菌种可靠，可以保存并投入大面积生产。实践证明，以上菌种质量的鉴定方法是比较科学的，可以筛选出优良菌种，为广大用户服务。
答：鉴定项目 序号服务项目菌种类别 1纯菌种鉴定（包含形态、理化、分子）细菌、酵母、放线菌、丝状真菌2功能基因鉴定（pheS、gryA、atpD等）乳杆菌、芽胞杆菌、双歧杆菌3产品微生物解析――4产品污染菌种鉴定――5菌群分析及纯种分离――6细胞壁化学组分分析（氨基酸）细菌、放线菌 7细胞壁化学组分分析（糖...
答：利用PCR技术从短小芽孢杆菌基因组中扩增出16srRNA序列，然后连接测序载体，送交上海英俊公司完成测序。测序结果提交到NCBI，并且进行比对分析，确定菌种的分类学位置。ps:高浓度食盐鉴定金黄色葡萄球菌。参考资料：http://www.helixnet.cn/bbs/thread-8181-1-1.html ...
答：1. 菌种:变形杆菌,伤寒杆菌18-24小时琼脂斜面培养物. 2. 培养基:尿素培养基. (三) 实验方法 1. 分别以斜面接种法将变形杆菌,伤寒杆菌接种于两支尿素斜面培养基上. 2. 置37℃培养18-24小时. 3. 取出观察结果,培养基变为红色,即尿素分解试验阳性,若不变色,即为尿素分解试验阴性. (四) 实验结果 ...
