革兰氏染色的实验方法

原理：
通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。

　　革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：

　　1）涂片固定。

　　2）草酸铵结晶紫染1分钟。

　　3）自来水冲洗。

　　4）加碘液覆盖涂面染约1分钟。

　　5）水洗，用吸水纸吸去水分。

　　6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分。

　　7）蕃红染色液（稀）染2分钟后，自来水冲洗，干燥，镜检。
不同厂家生产的试剂，各步骤的时间不一定相同。

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革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：
1）涂片固定。
2）草酸铵结晶紫染1分钟。
3）自来水冲洗。
4）加碘液覆盖涂面染约1分钟。
5）水洗，用吸水纸吸去水分。
6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分。
7）蕃红染色液（稀）染1分钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。 通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。
染色的差异主要是由于阴性与阳性细菌细胞壁的差异所引起的。
①革兰氏阳性细菌的细胞壁
G+细菌细胞壁具有较厚（20-80nm）而致密的肽聚糖层，多达50层，占细胞壁成分的40%～95%，它同细胞膜的外层紧密相连（图2-9）。有的G+细菌细胞壁中含有磷壁酸（teichoic-acid），也称胞壁质（murein），它是甘油和核糖醇的聚合物，磷壁酸通常以糖或氨基酸的酯而存在。由于磷壁酸带负电荷，它在细胞表面能调节阳离子浓度。磷壁酸与细胞生长有关，细胞生长中有自溶素（autolysins）酶类起作用，磷壁酸对自溶素有调节功能，阻止胞壁过度降解和壁溶。
如果细胞壁的肽聚糖层被消溶，G+细胞成为原生质体（protoplasts），细胞壁不复存在，而只存留细胞膜。除链球菌外，大多数G+细菌细胞壁中含极少蛋白质。
②革兰氏阴性细菌的细胞壁 G—细菌细胞壁比G+细菌细胞壁薄（15～20nm）而结构较复杂，分外膜（outer membrane）和肽聚糖层（2～3nm）（图2-10）。在细胞壁和细胞质膜之间有一个明显的空间，称为壁膜间隙（periplasmic space）。
外膜 G—细菌细胞壁外膜的基本成分是脂多糖（lipopolysaccharide,LPS），它同细胞质膜相同之处也是双层类脂，但除磷脂外还含有多糖和蛋白质。
LPS的多糖部分包括核心多糖和O-特异多糖。O-特异多糖由重复分支的碳水化合物分子组成，含有已糖（葡萄糖、半乳糖和鼠李糖）和二脱氧已糖。由于糖的种类不同，使各种G—细胞具有不同特性的LPS。核心多糖（core polysaccharide）的主要组分是酮脱氧辛酸（ketodeoxyoctonate, KDO）。
外膜中还含有几种蛋白，如脂蛋白、通透蛋白。有些蛋白具有通孔作用（porin），调控外界分子进入细胞；有的蛋白分子可以作为噬菌体的受体；许多G—细菌对高等生物有致病性是由LPS的成分决定的，它的毒性组分常称为内毒素（endotoxins）。
肽聚糖层 G—细菌细胞壁的肽聚糖层很薄，在大肠杆菌和其它细菌中仅有单
层。肽聚糖层和外膜的内层之间通过脂蛋白连接起来。
壁膜间隙 G—细菌细胞壁的外膜与细胞质膜之间存在明显的壁膜间隙，一层薄的肽聚糖处于其间，肽聚糖层和细胞质膜之间的间隙较宽，肽聚糖层至外膜之间的间隙较窄。大肠杆菌的壁膜间隙宽度为12～15nm，呈胶胨态。其间含有三类蛋白质：水解酶，催化食物的初步降解；结合蛋白，启动物质转运过程；化学受体（chemoreceptors），在趋化性中起作用的蛋白。 革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。