细菌的分子生物学鉴定要怎么做？
给你个论文，希望对你有帮助
现代真菌鉴定分型方法
北京大学第一医院(100434) 王端礼
真菌 的 鉴 定不仅是临床的需要，在植物病理学、生物退化、生物技术和环境的研究都很重要。许多真菌已经鉴定到种，但是分类学家仍在忙于新种的描述和其分类的研究。有些菌种由于经济学的关系或是病理学的重要性，有深人的研究，其他则需要现代手段来进行研究。
一 、 形 态学
用表 型 特 征来进行分类鉴定，是过去和现在都普遍应用的方法。致病真菌的鉴定，需要光镜，现在更加上荧光显微镜和细胞化学，还有各种染色法，如子囊泡子染色法。真菌在宿主体内鉴定比较困难，如菌丝只能看到有无分隔，有无色素。需要培养来鉴定菌种。某些病例用种特异性抗体探针非常有用，但此种技术尚未在医真菌学领域内作为常规技术使用。合适的培养基培养鉴定菌种，是常用的方法。
医学 真 菌 学家常见到的是半知菌，要看抱子形态和抱子发生，看产抱细胞，即分生抱子梗。有两种型，一是芽生抱子发生，在产抱细胞上有一小点产生分生抱子，另一是叶状抱子发生，整个细胞是产抱细胞，分成一至数个细胞。基于超微结构观察，有许多词语，但未能普遍应用。有的真菌没有分生抱子，但仍有一些特征，如菌核(sclerotia)、厚壁抱子和一些特殊的菌丝结构，如皮肤癣菌。在少数情况下，一些机会真菌产生有性结构，有许多特点用于菌种鉴定，如子囊菌、担子菌和结合菌。
电镜 ， T EM是观察菌的断面，子囊菌酵母和担子菌酵母的横隔不同，SEM在实际应用有许多发现，如子囊菌的表面结构可以鉴定到种。
现 代 形 态学技术，如自动成像分析、电子颗粒体积、分数几何学分析形态学的特点。
由于 表 型 各种词语没有一定的标准，有很大的主观性，某些表型特征也不稳定，受环境影响，有的不能在人工培养基上生长，有一些真菌尚未分类，分类概念有待近一步建立。
二 、分 子 生物学
表型 分 类 受限，生理生化技术在丝状真菌鉴定方面，或是费时费事或是结果不准。分子生物学非常适用。有两种技术，第一，PCR技术，可以分析少量真菌细胞，甚至单个真菌抱子。第二，选择通用寡核昔酸对真菌种特异性引物，测定其核昔酸序列。分子生物学的研究目的由于生物多样性有四个目的。I)系统发生研究。2)分类学的研究，在属、种水平。3)鉴定应用，即决定明确的分类名称。4)流行病学和群体的遗传学研究。具体方法不再详述。
三 、其 他 :
I，生 理 学 和生物化学
在纯 培 养 上真菌生长比较快，可以使用生理、生化方法来鉴定菌种。如黑酵母的鉴定。不同的生长温度也用于鉴定。有性和无性是一个辅助工具。在一定的培养基上，有对照，其生长速度也可用于鉴定，如青霉。AP[系统也用于丝状真菌的鉴定。
2. 次 级 代谢产物
次级 代 谢 产物既不是为了生长需要，也不是介导基本代谢，常常发现它是一个与分了有关的混合物，有特殊的和极罕见的化学结构。常见的是固醇、菇、类碱、香豆素等，某些是真菌毒素。将小量从培养皿切下来的标本，直接进行层析色谱法检查，比传统浓缩抽取提纯法简单易行。此法用于地衣的鉴定较好。很少用于真菌分类，由于对环境有一定影响，而且比较难，较少应用，但有人用于子囊菌的分类。
3. 泛 酉昆 系统
是一 种 初 级代谢产物，起重要作用。泛酿即辅酶Q，是呼吸系统电子传播链的携带者。一些异戊二烯(isoprene)接触醒核各有不同，对鉴定到属或属以下水平很有帮助。主要鉴定细菌和酵母，也用于黑酵母和丝状真菌。
(Ya ma da Y ,e tal. In t.J.Genet 1989;5 6:309 Y ag uchiJ > e tal .M ycoscience 1996;3 7:55)0
4. 脂 肪 酸组成
此法 在 细 菌学方面是常规应用的。一是成分，二是相对浓度。极少用于真菌分类。使用热解气相色谱法、热解块状光谱仪、气相色谱仪、隔膜水相聚合物双相系统等，主要应用这些方法。近来应用气相色谱法合并多变量统计分析方法，成功地用于丝状真菌，包括卵菌、担子菌、结合菌、甚至只有菌丝的真菌。用于种间水平。应注意许多变化，如培养状态和温度是最主要的。
5. 细 胞 壁组成
子 囊 菌 和担子菌含有几丁质和葡萄糖，结合菌含有脱乙酞几丁质(chitosen)和葡聚糖醛酸。不同的皮肤癣菌含有不同的糖分，醉母细胞壁或是缺乏或是含有少量其他多糖(如岩藻搪、乳糖、鼠李糖、木搪等)。
6. 蛋 白 质组成
用 电 泳 方法可以产生同工酶，可鉴定到属或种。电泳、免疫学方法、蛋白质分析等可解决种间特性。同工酶分析是一个经济和实用技术。等位基因酶(allozyme)通常用于系统发生的研究。
首先你要确定待鉴定的菌种一定是纯种 。如果菌种不纯，所观察到的现象则是混合现象，这样自然不会得到正确的结果。因此在鉴定之前，首先要将菌种纯化。 纯化方法，一般有2种：平板划线单菌落分离法和单细胞分离法。前一种操作简便，效果良好，适用范围广。
菌种鉴定的方法一般有常规鉴定和分子生物学方法：
（1）常规鉴定：菌落形态观察、革兰氏染色、菌毛染色、糖类分解实验、吲哚实验、淀粉水解实验、V-P实验、甲基红实验、柠檬酸盐利用实验、硝酸盐还原实验、接触酶实验等
（2）分子生物学方法：细菌16SrDNA菌种鉴定：提取DNA，特定引物PCR扩增，PCR产物纯化测序，进化树分析；真菌18S rDNA/ITS菌种鉴定流程也是一样的。
首先你要提出细菌的DNA。
方法如下：
1、液体培养及保种：从斜面上挑取菌苔于液体培养基中放摇床上震荡（转速160r/min）培养16小时。吸取菌液于1.5ml的经过灭菌的EP管中，再加甘油（30-40%）进行保种。（-80摄氏度保藏2年）
2、提取DNA（CTAB法）：
（1）取1.5ml菌液于1. 5ml离心管中，12000r/min离心2min，弃上清。
（2）向沉淀物中加入350ul双蒸水，重新悬浮沉淀。
（3）加入20ul10%SDS和3ul的蛋白酶K（20mg/ml），溶菌酶3ul，混匀，于50℃温育1h。
（4）加入50ul 5mol/L NaCl溶液，充分混匀，再加入50ul CTAB/NaCl溶液，混合后再65℃温育30min。
（6）冷却后加入等体积的酚(沉淀蛋白质)：氯仿：异戊醇（增强酚的作用）（25:24:1），小心上下颠倒混匀，12000r/min离心5min，将上清液转移到新的EP管，重复此步骤2-3次，直至分层界面无白色沉淀。
（7）加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），小心颠倒混匀，12000r/min离心5min将上清液转移到新的EP管。（纯化作用）
（8）加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，12000r/min离心15min弃上清。
（9）向离心管中加入75%乙醇，12000r/min离心5min洗涤DNA沉淀，小心弃上清，重复洗涤1次，弃上清将离心管倒置于吸水纸上，晾干。
（10）加入50ul（双蒸水）/ TE Buffer溶解DNA于4℃保存。
（11）电泳检测
6、PCR扩增：（细菌的通用引物为27F和1492R）将提取得到的DNA进行PCR扩增，电泳检测扩增得到的16S rDNA（如果菌类分明，条带清晰，PCR原液可直接送去测序，双向测通，得到测序序列后到NCBI的BLAST页面比对，得出鉴定结果）
7、酶切带型分型确定操作单元：将扩增产物用HhaI和HaeIII两种限制性内切酶进行酶切，电泳检测酶切产物，酶切带型相同的分为一个操作单元。
8、连接转化：从每一个操作单元中选取一株菌的16S rDNA进行连接实验。将连接产物转入感受态细胞中，将感受态细胞涂布于含有Amp的平板上，倒置培养12-16h。
9、克隆子挑选及PCR鉴定：从上一步的平板上挑取单菌落于含有Amp的液体培养基中震荡培养12h，以培养液为模板直接进行PCR扩增鉴定（1000-2000bp）。将含有目的片段的克隆子菌液低温保存。
10、测序：将含有目的片段的克隆子菌液送去测序。
11、序列拼接：运用DNAMAN软件对测序得到的序列进行拼接。
12、建树：对拼接得到的序列用Blast进行比对，最后将比对得到的所有序列运用MEGA6建立系统发育树。
答：是的，要做PCR。\x0d\x0a首先你要提出细菌的DNA。\x0d\x0a方法如下：\x0d\x0a1、液体培养及保种：从斜面上挑取菌苔于液体培养基中放摇床上震荡（转速160r/min）培养16小时。吸取菌液于1.5ml的经过灭菌的EP管中，再加甘油（30-40%）进行保种。（-80摄氏度保藏2年）\x0d\x0a2、提取...
答：最常用的方法是热变性法，其次是高效液相色谱法和浮力密度法。(2)DNA-DNA杂交：DNA杂交可得出DNA之间核苷酸顺序的互补程度，从而推断不同细菌基因组间的同源性。目前最常用的是复性速率法，同一菌的复性率为100%；80%～90%的同源为同一种内同一亚种的细菌；60%～70%同源性为同一种内不同亚种的细菌...
答：一、分子生物学鉴定方法 分子生物学鉴定方法是一种基于细菌基因序列的鉴定方式。随着基因测序技术的快速发展，这种方法因其准确性和高效性而受到广泛应用。通过提取细菌的DNA序列，利用特定的引物进行PCR扩增，然后与已知的细菌基因序列数据库进行对比，可以迅速鉴定出细菌的种类。二、生物芯片技术鉴定 生物芯片...
答：细菌鉴定的方法主要包括：形态学鉴定、生理生化鉴定、分子生物学鉴定等。一、形态学鉴定 形态学鉴定是通过观察细菌的外部形态、内部构造和染色反应来鉴别细菌。这种方法的操作相对简单。常见的形态学观察手段包括使用光学显微镜观察细菌的细胞形态和大小，或使用电子显微镜观察更细微的结构。另外，细菌对染料的反...
答：1.dna-dna杂交，该技术被认为是细菌分类和鉴定的“黄金法则”，主要方法如下：标记法、吸光度法、荧光强度法等。2.16srrna法：细菌核糖体的rna有三种类型，(23s、16s、5s)rrna，其中16s被认为作为生物系统发育和分类指标最为合适。3.细菌核心基因（看家基因），包括gyrb、rpob、groel、recn等。
答：DNA-DNA杂交技术是细菌分类和鉴定的重要方法，被誉为分类的“黄金法则”。该技术通过标记法、吸光度法和荧光强度法等手段进行。16S rRNA基因序列分析是细菌分类的另一个关键工具，因为16S rRNA被认为是最适合作为生物系统发育和分类的指标之一。此外，细菌的核心基因，如gyrB、rpoB、groEL和recN等，也被...
答：（3）常见的生化鉴定：如糖发酵试验、吲哚（靛基质）试验、淀粉水解试验、V-P试验、甲基红（M、R）试验、柠檬酸盐利用试验、硝酸盐还原试验、接触酶试验、氧化酶试验。（4）血清学鉴定：检定抗原型或血清型。（5）分子生物学鉴定：利用分子生物学手段进行细菌的种属、亚型的鉴定。（6）动物试验：测定...
答：1. 显微镜观察法：这是一种通过显微镜观察细菌形态、大小、排列方式等特征来鉴定细菌的方法。通过对细菌样本进行染色处理，然后在显微镜下观察其形态特征，如菌体形状、鞭毛数量等，可以初步判断细菌的种类。这种方法操作简便，但准确性相对较低。2. 分子生物学鉴定法：随着分子生物学技术的发展，DNA序列分析...
答：菌种鉴定的方法一般有常规鉴定和分子生物学方法：（1）常规鉴定：菌落形态观察、革兰氏染色、菌毛染色、糖类分解实验、吲哚实验、淀粉水解实验、V-P实验、甲基红实验、柠檬酸盐利用实验、硝酸盐还原实验、接触酶实验等 （2）分子生物学方法：细菌16SrDNA菌种鉴定：提取DNA，特定引物PCR扩增，PCR产物纯化测序...
答：鉴定细菌的方法主要包括：形态学观察、生理生化鉴定、分子生物学鉴定等。形态学观察。细菌的形态学观察是一种直观的鉴定方法。通常使用显微镜观察细菌的形态特征，如菌体的大小、形状、排列方式等。不同的细菌在形态上会有差异，以此作为鉴别依据。例如，细菌的形态包括球菌、杆菌和螺旋菌等。通过制作涂片并...
