人兽混合胚胎的“人兽混合胚胎，我们是第一例”

人兽混合胚胎研究引发了宣扬生命权的团体的强烈反对，这些团体担心该研究最终会导致“转基因婴儿”横空出世，甚至能够让卵子在不到两周内就能发育成熟。英国人工授精与胚胎学管理局原则上已经同意批准培育人兽混合胚胎的研究。这项研究涉及将人类DNA植入遗传材料已经被剔除的母牛或兔子卵子中。按照这一决定，研究人员的提议将在个案基础上进行评估。英国人工授精与胚胎学管理局称：“在分析研究了所有证据之后，我们认为阻挠这项研究毫无重要根据。民意在这个问题上分歧并不明显，只要研究得到严格控制，并能够带来科学和医学进步，反对这项研究的人也可能转变立场。”科学家之所以提出使用动物卵子，原因就在于人类卵子供应相当有限。　英国科学家驳斥了有关研究人员正试图“戏弄上帝”的批评。英国伦敦国家医学研究院医学研究委员会干细胞生物学部门主任罗宾-洛弗尔-贝基博士说：“我们不是在培育长着兔子耳朵的人。我们尝试从事的研究是了解各种疾病的病因及治愈方法，这也是整个医学界的目标。”这项备受争议的研究已经引起了部分公众的疑虑。独立监查组织“人类遗传学警报”(Human Genetics Alert)的主任戴维·金博士说，该研究的支持者歪曲科学事实来平息外界对他们的批评。在人工授精与胚胎学管理局的决定出台前，金博士在谈到公众对此问题的评论时说：“人工授精与胚胎学管理局一直以来就无视公众对这些试验强烈、明确的反对声。人们反对这种亵渎本性完整性的荒谬之举，他们的反对声音极为理性，但这个科研机构忽视甚至嘲笑他们，这本身就存在巨大风险。”英国政府之前一直提议将人兽混合胚胎研究宣布为非法行为，不过英国前首相布莱尔称他不会明确反对这种研究。反对者曾写信给布莱尔，敦促他重新考虑通过一项禁止人兽混合胚胎研究的法令。英国医学研究慈善协会女发言人索菲·佩蒂特-泽曼称，尽管反对者提出了道德问题，但遭受遗传疾病折磨的患者的权利同样应该得到尊重。佩蒂特-泽曼说：“这些患者清楚病痛让他们生不如死的滋味，大家也应该明白，如果不能减轻患者的痛苦，这同样是个道德问题。”一些科学家已向英国人工授精与胚胎学管理局提交了发放许可证的申请。他们的研究方法是，提取不再拥有自身DNA的母牛或兔子的卵子，植入人类遗传材料中，接着诱导卵子分裂，发育成早期胚胎，从中提取干细胞。经过这一过程处理的卵子含有13个可与2万至2.5万个人类基因作比较的动物基因。人兽细胞混合，即便是在分子水平上，也已引发了广泛争论。曼彻斯特大学生物伦理学教授约翰·哈里斯称，这一问题遭到了误读。他说：“反对者的担心是，科学家正试图将人与某些动物进行杂交。可不要忘了，你吃熏肉三明治的时候，你这是在把动物细胞吞到你的肚子里。”现在人工授精和胚胎管理机构在原则上为使用混合胚胎研究开了绿灯，但是有关研究还是会受到严格管理，有关研究申请都会受到单独审查。英国纽卡索大学2008年4月1日宣布，已成功制造半人半兽混合胚胎，这是英国学术界的创举，议会将于下个月投票表决规范人兽胚胎研究的法案。胚胎成活了3天，主要用于医学研究。“人兽混合”在医学上并非新生事物，它带来的更多是伦理上的争议。

你所说的就是生命科学研究上的嵌合体

嵌合体研究进展
1 嵌合体的概念
嵌合体(Chimera)一词源于希腊文,古希腊神话中用它
代表羊头、狮身、蛇尾这样一些由不同种类的动物所拼凑成
的怪物,这意味着人们改造自然的愿望。20世纪60年代中
期,在高等哺乳动物上得到了由两个或两个以上不同遗传性
状组成的胚胎发育成的个体,这种个体的组织器官是由基因
型不同的细胞群所组成,故称之为嵌合体。有的学者用非自
主表型(Allophene)一词代表这种个体,意指不同的表型是由
于有不同基因型的缘故。为了方便起见,Ford(1969)把在发
育的很早期,如卵裂期甚至受精卵期所形成的嵌合体,称为
原发性嵌合体(Primary Chimera);把在发育的晚期,如胚层
已分化,或器官开始形成后通过组织移植或嫁接等方法所形
成的部分组织或器官的嵌合,称为次生型嵌合体(Secondary
himera)。通常所说的嵌合体指原发性嵌合体,即人工地将
两个或两个以上具有不同遗传性状的早期胚胎,或者把具有
特种遗传性状的细胞和早期胚胎聚合或显微注射所产生的
嵌合体〔1〕。嵌合胚内不同来源的细胞相互调节、相互作用以
至共同完成胚胎发育。由于嵌合体能携带适当的遗传标记
并能在个体发育中表现出来,因而它成为研究所有动物个体
发育最为理想的实验材料和遗传研究模型。
2 嵌合体研究概况
2.1 小鼠嵌合体的研究进展
嵌合体研究至今已有80多年的历史。1942年,Nicholas
和Hall就曾试图用不同品系的大鼠,将其早期分裂球进行聚
合制作嵌合体,结果只得到一个死胎,未能证明为嵌合体。
之后,Tarkowski(1961,1963)〔2〕将具有不同毛色和葡萄糖磷
酸异构酶(Glucose Phosphate Isomerase,GPI)迁移率不同的两
种小鼠的胚胎,在卵裂的不同时期,如8-细胞期、16-细胞
期,甚至桑葚胚进行聚集,成功地制作了世界上第一只嵌合
体小鼠。通过毛色和同工酶的测定,证明这些嵌合体的各种
组织中都有来自两种胚胎的细胞。至此以后,嵌合体技术受
到了国内外哺乳动物发育生物学工作者们的极大重视。
Gardner在1968年又创建了囊胚注射法,并用这种方法
成功地获得嵌合体,因此法具有许多优点,可将不同类型的
细胞直接注射到囊胚腔内,所以成为目前获得嵌合体的主要
研究手段〔3〕。1981年,Evans和Kaufman〔4〕及Martin〔5〕首次
报道了从正常小鼠胚胎中分离建立了胚胎多能干细胞系,简
称ES细胞(Embryonic Stem Cells)。由于这种细胞来源于正
常胚胎,在细胞形态、生化特性、细胞表面抗原组成、体内外
分化能力等方面与分离的胚胎内细胞团(Inner Cell Mass,
ICM)十分相似,多数具有完整二倍体核型,可以有较高的频
率形成嵌合体。1984年,Bradley等〔6~8〕通过囊胚注射法获
得了首例小鼠ES细胞种系嵌合体,种系嵌合体的获得是实
现ES细胞介导的转基因途径的决定步骤。ES细胞种系分
化能力的保持是决定种系嵌合的前提条件,尽管可通过体内
外分化实验及全能性细胞分子标记推测ES细胞系是否具有
多方向的发育潜能,但嵌合体的制作及种系嵌合体的获得则
是判定ES细胞系是否具有种系分化能力的唯一方法。
Robertson等〔9〕及Gossler等〔10〕在1986年,分别以
PSVmos-1neo和pSVtkneoβ融合基因转化小鼠ES细胞
并成功实现种系传递,宣告了ES细胞途径的诞生。与原核
注射及逆转录病毒感染等其他转基因途径相比,ES细胞途
*为通讯作者。
径的优点在于ES细胞可在体外连续培养并保持发育全能
性,使得目的突变的筛选可在细胞水平而非个体水平进行。
尤为重要的是,利用基因组同源序列及合适的选择标记基因
可构建基因打靶(gene targeting)载体转化ES细胞获得小概
率的同源重组事件,进而经由种系嵌合体得到内源基因定位
致变(knock—out)或外源基因定点整合(knock—in)的突变品
系,这是迄今为止任何其他转基因途径所无法实现的。
1987年,Thomas和Capecchi将基因定位整合技术与ES
细胞途径相结合,首次获得了内源基因(Hprt)定位失活的转
基因小鼠。随后,人们以同样的方法成功地定位改变了一系
列的内源基因,例如:通过ES细胞对MT基因和对tPA基因
的研究,在分子和个体水平上使人们对这些基因有了更深的
了解,同时,也充分显示了ES细胞途径的潜力所在。宋震涛
等〔11〕在1993年,用囊胚注射法将小鼠胚胎多能干细胞—
CCE细胞注射到发育3.5 d的昆明和C57BL/6J小鼠受体囊
胚腔内,经假孕鼠借腹怀胎,获3只CCE细胞毛色嵌合鼠。
实验共注射胚胎654个,经培养其恢复成活率73.8%,胚胎
移植后,假母受孕率及产仔率分别为32.9%和53%。在所
获3只嵌合鼠中,2只为CCE—昆明毛色嵌合鼠,1只为
CCE—C57BL/6J毛色嵌合鼠,这是国内首次利用胚胎多能
干细胞获得嵌合鼠。同年,Wood等人报道了用ES细胞
R—1进行囊胚注射,注射后移胚631个,出生250只(40%),
嵌合体95只(15%)。Stewart等(1994)〔12〕按照Resnick〔13〕
的方法从7枚9dpc129/SV系小鼠胚胎PGCs分离并建立了
3个EG细胞系。待其观察到干细胞克隆时,将其转移到无
bFGF的PMEF上维持培养。对传至4代的EG细胞系做核
型分析及嵌合体实验,3个细胞系核型分别为40∶XY(EG1)、
40∶XX(EG3)、39∶XO(EG2)。将PGCs注射C57BL/6J小鼠
囊胚99枚,出生仔鼠62只,其中20只为皮毛嵌合体,嵌合
面积10%~90%,嵌合体正常。12只(5♀7♂)嵌合体小鼠
与C57BL/6J小鼠交配,出生539只后代,其中6只(4♀2♂)
嵌合体小鼠的169只后代为刺鼠型,证明这6只小鼠为生殖
系嵌合体。研究结果证实EG细胞与ES细胞同样具有形成
功能性配子和实现生殖系嵌合,产生嵌合体的能力。
1996年,吴白燕等〔14〕用北京大学生命科学学院所建立
的ES细胞系MESPU13通过囊胚显微注射到C57BL/6J小
鼠的囊胚中构建嵌合体小鼠。在注射了2~9个ES细胞的
136个囊胚中,127个囊胚(93%)经过3 h的培养后重新出现
囊胚腔。当把119个恢复的囊胚移植到假孕雌鼠的子宫时,
获得63只(52.9%)出生鼠。在59只存活到可以判定毛色
阶段的小鼠中,有21只(35.6%)被判定为嵌合鼠,显示了该
ES细胞系具有较高的嵌合能力。同年,何维等〔15〕采用源于
Swiss小鼠远交群的昆明品系小鼠囊胚成功建成了三个远交
系小鼠ES细胞系,核型正常率均达到70%以上,自第八代
起分批冻存。复苏后,培养至第12代,消化成单细胞,通过
囊胚显微注射,将其注射到615品系小鼠胚胎获得嵌合体,
这是首例用远交系小鼠胚胎干细胞系培育成功嵌合体小鼠。
在1999年,陈伟胜等〔16〕选用近交系C57BL/6J及远交系
KMW和ICR为受体胚胎提供者,分别通过囊胚注射法和
8—细胞期桑葚胚注射法进行了嵌合体构建实验。共获得嵌
合体81只,经毛色分析确定在进行测交的42只嵌合体中有
19只是种系传递者,为国内小鼠ES细胞种系嵌合体的首例
报道。通过对小鼠ES细胞囊胚注射后形成嵌合体,进一步
培育出整合于生殖系的小鼠品系。囊胚注射法制作嵌合体
这一套技术路线在制备基因剔除小鼠时已成功运用,该技
的优点是可以对每个单克隆细胞进行分析,并由此培育出
克隆细胞发育出来的小鼠。由于首先在ES细胞水平进行
操作,获得表达目的基因的单克隆细胞,经囊胚显微注射得
到表达目的基因的嵌合体小鼠,再由此培育出纯系小鼠,所
以在整个过程中ES细胞的分化潜能直接关系到小鼠的正常
发育。姚玉成等(2001)〔17〕为了探讨小鼠ES细胞参与早期
胚胎发育的潜能,以neo基因作为目的基因进行了ES细胞
的转染,经G418的筛选,获得表达neo基因的单克隆细胞,
然后进行囊胚注射60枚受体小鼠囊胚,恢复培养后移植到5
只假孕小鼠,得到了携带有neo基因的嵌合体小鼠,通过对
嵌合体小鼠各组织PCR分析发现,neo基因可以在皮肤、肝
脏、血液等多种组织中存在。
除了种内嵌合体,小鼠种间嵌合体早已有成功的报道。
虽然大小鼠嵌合胚、田鼠和小鼠嵌合胚能成功地附植,但没
有成活的嵌合体出生。Rossant用ICM注入法,首次获得了
小鼠种间嵌合体(Mus musculus←→Mus caroli)。在嵌合体内
没有发现细胞系之间的选择性排斥关系。用GPI酶分析,显
示骨骼肌中有杂交的GPI酶,说明两种不同来源的成肌细胞
融合为正常功能的肌纤维。正常小鼠胚胎与多倍体胚胎、雌
核发育胚胎所制作的聚合胚也分别被用来进行了大量嵌合
体的研究〔18~20〕:正常胚胎在细胞松弛素B作用下,染色体
加倍形成三倍体或四倍体胚胎。这种多倍体胚胎发育迟缓、
组织畸形,即使出生也不能存活。与正常胚胎嵌合后,3n或
n细胞虽参与各种组织形成,但仍影响正常胚胎发育。Lu
1980)和Azuma(1991)分别获得了成活的4n←→2n、3n←→
n嵌合小鼠,并具有正常生殖能力,繁殖实验证明,所有的后
代均为2n细胞来源。这种多倍体胚胎嵌合体在研究性染色
体及剂量补偿作用、多倍染色体对个体发育的影响方面具有
重要价值,是研究染色体功能、基因平衡、基因定位的良好模
型。单性生殖胚胎(Parthenogenetic Embryo)是将受精卵中
的雄原核或雌原核挑去,在用细胞松弛素B使其染色体加
倍,从而得到正常胚胎数目的染色体。由于XY型为致死
型,因而这种加倍后的胚胎皆为XX型。这种雌核发育胚胎
在附植后很快死亡。Stevens(1978)〔18〕将1枚正常受精的小
鼠胚胎与2枚孤雌发育的桑葚胚,去除透明带后在Whitten
氏液中聚合培养,形成3胚聚合的胚胎;将55枚3胚聚合胚
移植至6只假孕雌鼠,产出两窝共7只仔鼠,经检测其中1
雌性和1雄性仔鼠为嵌合体。证明源于孤雌胚的细胞能存
活并参与形成正常的器官。雌核发育胚胎能广泛形成嵌合
体各种组织。但成活个体在体型上均小于正常小鼠。与多
倍体胚胎不同,雌核发育胚胎能参与嵌合体生殖系形成,并
产生有功能的卵子。Market等( 1978 )〔21〕和Petters
1980)〔22〕还得到了由3个或4个胚胎聚合而成的6个双亲
和8个双亲的小鼠嵌合体及其后代,不过这种6个以上双亲
的嵌合小鼠,选择遗传标记更加困难。这类嵌合体对研究
巨型”胚胎的生长和调节等具有一定的价值。
上述研究结果表明,虽然迄今还没有完全由孤雌胚发育
而成的后代,但因孤雌胚细胞可参与形成各种组织包括生殖
细胞,故可能通过缺少父源遗传结构的生殖系仅将母源的遗
传信息传给后代。换句话说,通过嵌合体技术可能产生孤雌
发育的个体。因此,有必要深入研究。
2.2 其它哺乳动物嵌合体的研究进展
由于家畜胚胎的发育特点,体外培养条件与小鼠相比差
异较大,有关家畜嵌合体方面的报道比较少。
.2.1 羊:Pighills曾首先尝试用桑葚胚聚合法制作嵌合体
绵羊。最初用ICM注入法制作嵌合体的成功率不及3%。
utler(1985)发现ICM注入法同样得到较高比例的嵌合体绵
羊。且在制作聚合胚时发现,当细胞数量比正常胚胎多时则
易形成嵌合体,而细胞数量少于正常胚胎时则产生嵌合体的
比例明显下降,其原因可能是细胞数量多时,参与ICM的机
会增加。1998年有人成功地报道了把从山羊胎儿采取的原
始生殖细胞在STO细胞上继代培养,这些细胞从形态特征,
对AKP阳性的反应及在体外分化成各种细胞的全能性来
看,确定是山羊EG细胞。但是,关于嵌合体形成没有得到
验证。嵌合体显示对两个细胞系的免疫耐受性,这同样适用
于种间嵌合体,因而种间嵌合体成为母体与胎儿免疫识别机
制及研究妊娠失败的良好模型。Fehilly(1984)分别用聚合法
和注射法制作绵山羊嵌合胚,然后移植到与受体胚泡同种的
假孕受体,结果绵羊和山羊能分别产下正常的种间嵌合体。
尽管雌性绵山羊等嵌合体能生产正常绵羊胎儿,但却不能怀
孕山羊和杂交种胎儿。其失败的原因可能是一种母体的细
胞毒性抗体对种特异性抗原的反应引起的。
2.2.2 牛:牛嵌合体的报道也有几例。最初用ICM注入法
制作种间嵌合体(Bos indicus←→Bos taurus),尽管没有产生
外观可见的嵌合牛,但生化检测表明内脏器官存在嵌合
性〔23〕。Brem(1984)〔24〕获得一头嵌合牛,此牛是由4个半胚
组成的聚合胚发育而成的,与绵羊嵌合体的发现相同,可能
聚合胚中细胞数量越多时,不同细胞系参与形成ICM的机
率相应提高。Picard(1990)〔25〕将8 d ICM与5.5 d桑葚胚聚
合后得到5头嵌合牛,说明8 d ICM仍能参入嵌合牛中ICM
的形成,同时发现10 d的ICM与5.5 d胚胎能形成聚合胚,
但不能参与成体发育。Cibelli〔26〕利用转基因技术得到了生
殖系嵌合牛,在1998年,用显微注射法把将囊胚建立的细胞
系导入基因后的基因转移细胞系注入受体胚,制作了转基因
嵌合体牛。另外,基因导入后的胎儿成纤维细胞,注入去核
的卵母细胞,所形成的囊胚建立起的转基因细胞系,同样具
有形成嵌合体的能力。结果表明,判定这些细胞株为牛ES
细胞。但是,牛生殖系制作嵌合体未见报道。
2.2.3 猪:在1990~1991年猪ES细胞的建立有许多报道,
但是,所有形式的判定标准,形态特征,未能测出在体外的分
化能力,胚体形成或者细胞标记物腊丁18(细胞分化标记
物),没做获得的细胞嵌合体形成能力的实验。在1992年,
Kashiwazeki采用ICM注入法将白化品系ICM注入褐色被
毛受体囊胚中,产生了2头嵌合猪。Mueller等(1999)自30
个25~28 dpc WAPhGH转基因猪胎儿生殖嵴分离PGCs,将
其注射到209枚6日龄猪囊胚,重组胚移入11头受体猪,用
转基因标志作PCR试验,分析49个胎儿和8头仔猪PGCs
是否参与嵌合,检测结果32个胎儿呈现5/12种组织嵌合,8
头仔猪为皮肤基因转染,其中4头表现皮色嵌合。
3 嵌合体的制作方法
迄今为止,制作嵌合体的方法有两种,即聚合法和囊胚
注射法,可根据实验目的而选用。
3.1 聚合法〔27~34〕
聚合法是用胚梁将除去透明带的两枚8细胞至桑葚期
胚胎或来自两个胚胎的分裂球与ES细胞聚合在一起,称为
聚合法。聚合法适用于同种,发育阶段处于同步或者差距不
大的胚胎。其方法是在2个8细胞胚胎中间夹几个ES细
胞;1993年,Wood等〔27〕人报告了一种简单、有效的产生嵌合
鼠(包括种系嵌合鼠)的方法,该方法仅需要将ES细胞同8
细胞时期的胚胎进行简单的共培养即可完成。1997年,何维
等〔28〕以MC15为供体ES细胞,用KMW品系小鼠8细胞期
的胚胎为受体胚胎,采用聚合法共植入8细胞期胚胎35个,
产仔18只,产仔率51.4%,获得嵌合鼠2只。用聚合法制作
嵌合体,操作简便,不需要特殊的仪器设备,是制作嵌合胚和
嵌合体动物的有效方法。
3.2 囊胚注射法〔25~44〕
囊胚注射法技术难度较大,但适用范围较广,可用于种
·3·《上海畜牧兽医通讯》 2008年第3期
或种间,供体和受体的发育阶段可同步,也可以是不同步
,它还适用于不能去透明带的动物,如兔等。该法是将几
个ES细胞(一般5~15个左右)注入囊胚腔中。但囊胚注射
法需要购买昂贵的仪器,而且技术难度较大,需要一定的时
间才能掌握。
4 嵌合体鉴定〔45〕
嵌合体鉴定也称嵌合体标记(Markers of chimera)或嵌合
体分析(Analysis of chimea),通过鉴定所选择的不同细胞系
的遗传标志在嵌合体中的出现,即可判定是否不同培养细胞
参与了嵌合胚的发育。迄今所用的嵌合体鉴定方法可分为
人工标记和遗传标记两种方法。
4.1 人工标记
此种方法多用于蛙类嵌合体的鉴别,哺乳动物中较少应
用。其最典型的标记物为活体染色色素和油滴。此外使用
的标记物还有0.1~0.2μM的珠状物,放射性物质、荧光胶
质金、黑色素颗粒、山葵过氧化物等。
4.2 遗传标记
它是根据嵌合体在嵌合前两个胚胎本身所具有的特性
作为标记来进行鉴定,如由遗传所决定的黑色素以及通过生
物化学、染色体、细胞学、组织学、组织化学、免疫组织化学等
方法能够鉴别的物质等。为了检测ES细胞的嵌合程度,目
前通常是采用两个遗传标记。
.2.1 色素分析法:这是最简单且直观的分析方法,一般选
择皮肤颜色、毛色差异的动物胚胎来制作嵌合体。由于供体
ES细胞与受体胚胎来源品系有明显的毛色区别,故可根据
移植后代是否具有ES细胞来源的毛色明确判定嵌合体。嵌
合体的毛色嵌合程度按ES细胞来源毛皮所占大致比例估
算,结果以百分率表示,外观无受体品系毛色掺杂的嵌合体
毛色嵌合程度计为100%。在嵌合体构建实验中,通常以嵌
合体的毛色嵌合程度推测内脏(尤其是种系)的嵌合程度。
在毛色嵌合程度较高的嵌合体中,种系嵌合的发生及种系嵌
合程度似乎是随机的,与毛色嵌合程度无明显的相关性,这
说明毛色嵌合程度与脏器嵌合程度并不完全平行。因此,有
必要对毛色嵌合程度较低的嵌合体也进行测交分析。
.2.2 生物化学法:主要通过测定嵌合体血液或组织中的
特定酶(同工酶),如磷酸葡萄糖异构酶(GPI)、磷酸葡萄糖变
位酶(PGM-1)、6-磷酸葡萄糖脱氢酶(6-PGDi)等,也可
以根据细胞抗原、血清运铁蛋白和白蛋白类型来确定是否有
亲缘关系,以鉴定是否是嵌合体。GPI同工酶分析方法相当
灵敏,其灵敏度约为2%〔46〕,用很微量的样品就可以达到分
析目的。虽然目前已有了一些更为灵敏的方法,如使用PCR
法〔47〕或利用小卫星DNA〔48〕的方法。但由于GPI方法的快
速、简便和价格适中的优点,仍是目前广泛使用的方法。GPI
广泛存在于动物体内的所有组织细胞内,非常稳定,主要催
化六磷酸葡萄糖和六磷酸果糖的互变反应。在小鼠中,GPI
-1基因位于第7染色体上,绝大多数近交系小鼠的基因型
为纯合的GPI-1a或GPI-1b,a和b为两个共显性的等位
基因。在进行电泳时,根据等位基因a和b的不同,可以得
到A型和B型的条带〔49〕。通常在构建嵌合体鼠的实验中,
选择带有与供体细胞不同的等位基因的胚胎作为受体,有利
于对嵌合鼠体内组织器官中的嵌合情况进行分析。
5 嵌合体的应用前景
对哺乳动物基因组进行人工改造,最终是为了获得带有
人们所期望的目的性状的转基因动物,这是哺乳动物遗传工
程研究的一项重大课题。哺乳动物发育的基因调控在过去
由于种种原因(如哺乳动物突变种很少,生命周期长,胚胎是
在母体子宫中发育,数量少等)难以有很大进展。随着ES细
胞的建立,可以在培养瓶中进行突变和筛选,并且筛选出来
的突变细胞株可以经受反复的冻存和复苏,还可以进行嵌合
体分析和分子遗传学分析。或运用体细胞遗传操作技术,在
细胞水平上对带有遗传修饰的转化ES细胞进行有效的筛
选,最终使目的基因整合到生殖细胞中,并传入后代成为种
系嵌合体。由于嵌合体动物在胚胎发育过程中的特殊性,它
不仅是遗传工程的重要组成部分,而且可以作为发育生物
学、细胞生物学、胚胎学、免疫学、医学、畜牧学等方面均具有
广泛应用价值。它既为这些研究提供特殊的动物模型,也可
用于人工创造特殊的动物。
5.1 研究染色体畸变
在对许多遗传病的研究中,发现许多体细胞核的染色体
是非整倍体(Aneuploid),其中单体和三体(Trisome,Ts)最常
见。非整倍体←→2n嵌合体是研究染色体功能、基因平衡、
基因定位的良好模型。在哺乳动物含有非整倍体的个体往
往伴有严重的遗传障碍,一般不能存活。目前人们借助EC
细胞或生化手段已经构建出含有单体或三体染色体的小鼠
嵌合体。
5.2 研究基因突变
在20世纪80年代获得小鼠ES细胞以来,ES细胞在基
因工程领域受到普遍重视,将ES细胞注入受体囊胚是其完
成个体发育的唯一途径。通过基因的同源重组技术可将突
变基因导入ES细胞,当携带突变基因的ES细胞参与嵌合体
生殖系组成后,即可在繁殖后代中研究突变基因的作用。
Goldstein等(1979)证明EC细胞具有高度亲合低密度脂蛋白
的受体,并进一步准备诱发低密度脂蛋白受体缺损株,把这
种细胞注射到囊胚中,从而有望获得与人类高胆固醇血管症
相同的动物模型。1987年Hooper等〔50〕人(英国爱丁堡大
学)以及同年Kuehn(英国剑桥大学)分别从ES细胞中通过
自发突变或诱发突变得到了HPRT-的ES细胞,并通过嵌
合体和嵌合体的繁育得到了HPRT缺陷型的小鼠模型,为研
究人类遗传病Lesch-Nyhan综合征(是由于不能合成雌黄
嘌呤转磷酸核糖激酶而引起)提供了良好的遗传研究模型。
5.3 转基因动物生产方面的应用
从20世纪60年代开始,经过体细胞遗传学家和病毒学
家的长期努力,已经建立起许多成熟的技术可以将外源基因
导入体外培养的细胞并得到稳定表达的转化细胞系。但是,
由已经分化的在体外培养的体细胞无法产生哺乳动物,而哺
乳动物的受精卵或早期胚胎细胞又受到数量和可培育时间
与条件的限制也无法使用这些成功的方法。ES细胞系的建
立将体细胞转化技术和嵌合体技术结合起来,建立了转基因
动物的新途径。Gosseler(1986)、Tokunaga等(1992)利用磷
酸钙方法将neo基因导入ES细胞,并获得了能稳定传递neo
基因的转基因小鼠,显示用ES细胞作为转基因工具与DNA
原核注入法、逆转录酶病毒感染方法相比具有一定的优越
性。主要是可以在细胞水平获得明确的转入基因是否整合
或表达,再由这种明确的细胞发育成个体,避免了对子代小
鼠既要进行DNA水平检测筛选,又要进行RNA或蛋白水平
检测筛选,从中才能获得转基因小鼠的过程,直接就可以获
得整合或表达目的基因的嵌合体小鼠,尔后通过培育获得转
基因小鼠,这为将来进一步探讨该技术的广泛应用奠定了基础。
5.4 嵌合体在胚胎种间移植方面的应用前景
胚胎种间移植,对保存濒临灭亡的动物、克服杂交不育
等方面具有重要意义,但是由于种特异性抗原的相互作用关
系使胚胎种间移植受到极大限制。迄今有关胚胎种间移植
获得成功的报道有:家牛与水牛的交互移植、马与驴的交互
移植、欧洲盘羊移植到家绵羊、野牛胚胎移植到Holstein母
牛、斑马胚胎移植到马等。杂交胚胎细胞能参与正常胚胎发
育,其原因可能是因为胚胎滋胚层与假孕母体属于同一种
类,从而屏蔽母体的种特异性抗原对异种胚胎的ICM的免
疫识别,使异种胚胎能够存活。在制作的绵山羊嵌合体中,
绵羊和山羊能分别产下山羊和绵羊羔,如果这种方法在濒危
动物种类上有可行性的话,有可能为“挽救”濒危动物开辟了一
·4·《上海畜牧兽医通讯》 2008年第3期
全新的途径,可望在实际应用中不断扩大珍稀动物数量。
5.5 嵌合体在繁育纯系动物中的发展前景
在哺乳动物纯系繁育过程中,培育良种的时间是重要的
因素。例如,培育纯系小鼠需要进行20代近交繁殖(约5年
时间),并且最多产生98%的纯合体,此外由于近交衰退导致
生命力和繁殖力降低,因而大多数动物近交繁殖均告失败。
arkert等(1977)报道用显微外科方法制作雌核发育胚胎以
来,为繁育纯系动物提供了最简捷的方法。Stevens、
ndregg、Paldi分别获得了含有雌核发育胚胎的嵌合小鼠,并
得到了含生殖细胞嵌合的个体。这种个体的卵巢有雌核发
育胚胎来源的完全一致的卵子,从而大大缩短了培育纯系小
鼠的时间(约3个星期)。
6 目前研究存在的问题
如上所述,嵌合体在发生学、医学、产业的各个领域有着
无限广阔的利用前景。但目前需研究和解决的问题有:
高效培育嵌合体的方法,特别是通过种间或各种细胞的
组合获得嵌合体;培育各组织、器官的特异性部分嵌合体个
体;消除种间的胚胎着床后发育与受体间的免疫排斥性;研
究更适合的标记。

最近英国原则上批准了一类人兽混合胚胎实验。其实类似的研究在中国早已进行，并发表了论文。但由著名科学家盛慧珍领导的这一工作目前已基本中断，整座大楼显得空空荡荡
9月5日，英国“人工受精与胚胎学管理局”(HFEA)原则上批准了一类人兽混合胚胎的实验，这事实上是对英国纽卡斯尔大学和国王学院等研究机构在一两年前提出的研究申请的回应。
该管理局将根据科学家的研究申请，逐个进行审查。这意味着英国科学家终于可以正式进行这类人兽混合胚胎研究。
说是一类研究，是因为异种混合胚胎的实验实际上有三个等级：
第一种是将某种动物的精子与另一种动物的卵子结合为受精卵，这类研究在伦理上是最不允许的，而且存在多种技术障碍。
第二种叫“嵌合体”，就是将一种动物的胚胎干细胞注入另一种正在发育的动物胚胎中，令其发育为两种动物细胞混杂的胚胎，其最终目的是为人体器官修复提供备件，英国方面还没有给这类实验“开绿灯”。
第三种也就是这次批准的实验类型，具体来说，是运用体细胞核转移技术，将一种动物的细胞核注入去核的牛或兔、羊的卵母细胞，以培养早期胚胎（囊胚），并从中提取胚胎干细胞。
首个发表论文的机构
“异种混合胚胎的实验，我们一直在搞，而且是国际上首个正式发表论文的研究机构。”陈学进不无自豪地说。
陈是上海交通大学医学院附属新华医院发育生物学研究中心的主任，他所说的“我们”，是指盛慧珍在这个研究所时带领的研究团队，当时，陈是她的副手。这个研究所在新华医院旁一个不起眼的小巷子里，占用了一栋白色的5层楼。“英国人事实上是要重复我们的工作。”陈学进说。
1999年，盛慧珍离开工作了十多年的美国国立卫生院（NIH）的实验室，回到国内，担任当时的上海第二医科大学发育生物学研究中心的主任，并在以后承担了973“干细胞的基础研究与临床应用项目”。2002年，《自然》杂志曾以《干细胞研究在东方冉冉升起》为题介绍盛慧珍和其他一些中国科学家的工作。现在这篇文章还贴在发育生物学研究中心的一楼，但是，盛慧珍已经离开了这个研究团队，去美国继续研究工作。
2003年，盛慧珍成了国内外媒体和科学界瞩目的科学家。那年8月，她领导的研究小组运用克隆技术，从外科废弃的皮肤组织中提取细胞，并将这些细胞融合到新西兰兔的去核卵母细胞中，成功获得数百个融合胚胎，其中有一百多例发育至囊胚阶段，并提取得到了胚胎干细胞。这篇论文当时发表在国内的《细胞研究》（CellResearch）上，这也是国内影响力最大的国际性学术刊物。《自然》、《华尔街日报》、《华盛顿邮报》均在文章发表的同一天和第二天做出了评论，因为这是国际上第一例人兽胚胎融合成功的报道。
陈学进说：“去年英国为了人兽胚胎研究的工作而召开听证会，邀请了国际上三个专家，盛老师就是其中之一，这也说明她在这一领域的学术地位。”
不得已的手段
将人兽细胞融合，其实是科学家不得已的手段。
人类的体细胞，比如皮肤细胞，是一种专门化的细胞，早就丧失了发育成胚胎的能力。但是，干细胞研究却发现，如果将卵母细胞的细胞核去掉，代之以这种体细胞的细胞核，就有可能让体细胞返老还童。
卵母细胞如同神奇的魔法师，它含有的胞质物质，唤醒体细胞细胞核中潜藏的能力，并能让它发育到囊胚阶段，这样，科学家可以从中提取出胚胎干细胞——这类干细胞具有发育成所有种类细胞的可能性，将它们植入一些病人受损的脊髓、角膜、脑区，可能起到修补工的作用，帮助治疗一些曾认为回天无术的疾病，这就是所谓的“治疗性克隆”技术。而且，如果使用病人自己的体细胞，还可以消除免疫排斥的问题。
可惜，这个技术并不成熟，成功率非常低，这就需要大量的卵母细胞。但是，从女性身上直接采取卵母细胞是非法的，陈学进介绍说，“只能与开展试管婴儿项目的机构协作，经同意，拿到一些多余的废弃卵子”。在没办法的情况下，科学家只好退而求其次，向动物要卵母细胞。好在动物的卵母细胞同样能“激发”人类的体细胞。
但是，这项技术用到人身上，就得经过伦理方面的检查。虽然DNA主要在细胞核中，但细胞质中也有少量的遗传物质，即线粒体。它负责编码13个基因，主要功能是为生命活动提供能量。虽然比起细胞核中的几万个人类基因，这13个线粒体基因只是少量的“杂质”，然而人们担心，如果有人将这些混合胚胎发育成个体，这些家伙将给伦理学带来重大难题。
但是，在科学家看来，这种担忧只是杞人忧天。研究发现，大部分的情况下细胞中的动物线粒体会随着胚胎发育逐渐丢失。再则，线粒体只是供能单位，并不编码与“人”特征有关的任何蛋白。但最关键的一点是，胚胎干细胞研究有条伦理底线，那就是人兽胚胎绝不允许被植入子宫内，而且在胚胎发育到14天以前就得把它毁掉。“这些胚胎最多到14天就终止了，而且不允许重新植入人或动物的子宫，不可能繁殖后代。明确了这些界限，也许会消除一大半的忧虑。”国家人类基因组南方研究中心伦理学部主任沈铭贤说，因此“国内对这方面的基础研究不限制”，正是沈铭贤所在的部门在当年为盛慧珍的论文作了伦理审定，他们的结论是“应予支持，但不能应用于临床” 。
为什么不能应用于临床，沈铭贤解释说，因为还是有风险的，动物的线粒体“会不会与人的线粒体或别的成分发生相互作用，科学家并不知道”。更大的风险还是病毒，“有的病毒对人有害对动物却无害”。因此，这方面的研究必须“慎之又慎，科学上严格准入，伦理上严格把关”。
“我们的积累断了”
但是，973项目结题后，盛慧珍不再被交大医学院续聘，她离开了这个团队，主要在美国从事研究工作。关于盛的离开，“原因很复杂。”陈学进说。
“技术上依然存在问题。”陈学进承认。2003年的那篇文章，差点可以发在《美国国家科学院院刊》，甚至已经被制成小样准备印刷，但是美国有专家不同意，因为对“囊胚中可以分离出胚胎干细胞”这一项的实验论证有争议，只好发表在国内的《细胞研究》上。而后来，“又陆陆续续做了一些这方面的工作，侧重研究机理，但是实验的重复性不好，成功率也不高。”陈学进说。
人兽胚胎的研究难度很大，除了盛的工作，在国际上还没有正式发表的论文，陈学进认为，这个研究团队的工作还是不错的，在干细胞领域发表了不少文章，在国内国际处于领先地位，但是“国家和上海市不准备再支持了”。
沈铭贤则认为，因为伦理上的一些争议，人兽胚胎的研究不容易得到正式发表，“国际上有支持也有反对的”，这是导致盛慧珍离开的“一部分原因”。但是肯定还有别的因素，“原因很多”，作为当年为盛慧珍工作做伦理审定的专家，沈铭贤跟盛慧珍比较熟，但是“作为局外人，很多问题我不方便说”。“盛老师比较失望。”李峰觉得。李峰是盛慧珍亲自招入的博士后，盛走了以后，他一直在这个研究所继续工作。李峰认为“盛老师对周围环境不满意，她如果选择留下来，肯定是有能力拿到项目资助的”。
但是盛慧珍还是选择了离开。因为盛的离开，这个研究所现在得到的资助很少，“与中科院合作的部分停止了，仪器被收回去了一部分，其他的我们借到年底，现在主要靠我申请到的项目资助。”陈学进说，“但是很难。”
这个5层楼的楼房原先有四五十个学生，但是现在只剩下十多个，楼里显得空荡荡的。陈解释说，“因为实验大多在晚上做。我们现在主要做克隆猪的实验，要从屠宰场取新鲜的卵母细胞，而屠宰场杀猪是在晚上。”克隆猪是他现在的研究课题，这是陈学进与农委合作的一个项目。
而李峰还在做盛慧珍留下的延续课题，是与中科院动物所的陈大元研究组合作，做“人牛胚胎”的遗传分析，动物所那边将人的体细胞与牛的卵母细胞融合，发育成胚胎，“已经拿到囊胚了，我们来做分析。”李峰说，“这也是盛老师的意思，她想在多个物种上证明她的结果，因为不同动物的卵母细胞的重编程能力不一样。有可能牛的就更容易成功。”但是现在他们只能做到囊胚，“不能继续从囊胚中分离胚胎干细胞”，因为“结题了，没有资金支持了”。
陈学进说：“很多学生毕业就出国了，国内很难留住优秀的学生，李峰做完这期博士后以后也要出国。但是科研需要积累，不能断，很多工作我们不做就失去了机会。”“盛老师走了以后，我们这里的积累就断了。”陈学进有点痛心。
研究应该有延续性
除了盛慧珍正式发表论文外，国际上做人兽克隆实验的尝试并不少。1998年，美国一家私营的“先进细胞公司”曾将人的面颊细胞核注入去核的牛卵母细胞，克隆出胚胎干细胞。陈学进说，“现在各国都在搞”，因为这方面的“前景很好”，如果治疗性克隆技术能得以突破的话，帕金森病、早老性痴呆等重大疾病的治疗都有可能得到突破。
对人兽“嵌合体”的研究也很多。今年3月，美国内华达大学的伊斯梅尔·赞加尼教授培育出拥有15%人类细胞的绵羊，这项工作是将人的胚胎干细胞注入胎羊体内，这样，羊的胚胎在发育过程中将与人的胚胎干细胞混合生长，最终长成的成体羊混杂有人类细胞。这则“人-绵羊嵌合体”的报道曾在国内外激起很大反响。
其实，在中国也有类似的研究，上海交大医学院的黄淑帧、曾凡一等人培育出了世界上第一头“人-山羊嵌合体”，相关论文发表在去年5月的《美国科学院院报》上，证明人类干细胞可存活于山羊体内。这类研究的意义在于，人类将可能从动物身上获得具有部分人类细胞的肝脏、肾脏、心脏等脏器，可用于人类器官移植手术。
今年6月6日，来自美国和日本的三个科研小组分别对正常小鼠细胞进行基因重组改造，成功制造出“胚胎干细胞”，相关研究结果刊登在《细胞·干细胞》杂志和《自然》杂志网站上。这项研究将体细胞直接转变为胚胎干细胞，如果能在人类身上实验成功，就将回避长期以来围绕人类胚胎使用问题的伦理争论，被认为是干细胞研究领域的一项重大突破。
陈学进说，“如果这项工作能成功，治疗性克隆就不用搞了，”但是他认为，“研究都是有延续性的，只有不断地尝试，才有可能有重大突破。”