动物细胞贴壁培养的方法有哪些
关于细胞工程的定义和范围还没有一个统一的说法,一般认为,细胞工程是根据细胞生物学和分子生物学原理,采用细胞培养技术,在细胞水平进行的遗传操作。细胞工程大体可分染色体工程、细胞质工程和细胞融合工程。
八、细胞工程
关于细胞工程的定义和范围还没有一个统一的说法，一般认为，细胞工程是根据细胞生物学和分子生物学原理，采用细胞培养技术，在细胞水平进行的遗传操作。细胞工程大体可分染色体工程、细胞质工程和细胞融合工程。
1．细胞培养技术
细胞培养技术是细胞工程的基础技术。所谓细胞培养，就是将生物机体的某一部分组织，取出一小块进行培养，使之生长、分裂的技术。细胞培养又叫组织培养。
在体外细胞培养中，供给离开整体的动植物细胞所需营养的是培养基，培养基中除了含有丰富的营养物质外，一般还含有刺激细胞生长和发育的一些微量物质。培养基一般有固态和液态两种，它必须经灭菌处理后才可使用。此外，温度、光照、振荡频率等也都是影响培养的重要条件。
植物细胞与组织培养的基本过程包括如下几个步骤：
第一步，从健康植株选择用于培养的起始材料（外植体）。
第二步，用一定的化学药剂对外植体表面消毒，建立无菌培养体系。
第三步，形成愈伤组织和器官，由愈伤组织再分化出芽并进一步诱导形成小植株。
动物细胞培养有两种方式。一种叫非贴壁培养：是细胞在培养过程中不贴壁， 条件较为复杂， 难度也大一些，但是容易同时获得大量的培养细胞。一般用于淋巴细胞、肿瘤细胞和一些转化细胞的培养。另一种是贴壁培养：也称为细胞贴壁。贴壁后的细胞呈单层生长，所以，此法又叫单层细胞培养。大多数哺乳动物细胞的培养，必须采用这种方法。
动物细胞可以离体培养，动物细胞培养的主要步骤如下：
第一步，在无菌条件下，从健康动物体内取出适量组织，剪切成小薄片。
第二步，加入适宜浓度的酶与辅助物质进行消化作用使细胞分散。
第三步，将分散的细胞进行洗涤并纯化后，以适宜的浓度加在培养基中，37℃下培养，并适时进行传代。
在细胞培养中，我们经常使用一个词——克隆。克隆一词是由英文clone音译而来，指无性繁殖以及由无性繁殖而得到的细胞群体或生物群体。自然界存在天然的克隆，如同卵双胞胎。
单克隆是指由一个细胞进行无性繁殖而形成的细胞群体，我们从经过消化而分散开的动物细胞中，挑选一个出来进行培养，就是单克隆。
基因工程中，还有称为分子克隆，是指发生在DNA分子水平上，从一种细胞中，把某种基因提取出来作为外源基因，在体外与载体连接，再将其引入另一受体细胞，自主复制而得到的DNA分子无性系。
动物细胞贴壁培养的方法有组织块培养法和消化培养法。
贴壁细胞培养方法操作步骤 ：
1．用盖片镊将盖玻片自75%乙醇中取出，用无菌丝绸布擦拭干净，不要用纱布；
2．将盖玻片轻轻放入6孔培养板（每孔一片）或培养皿中（每个平皿可放置2-3片）；
3．在距离紫外灯直射范围内20-30 厘米处照射2-3小时；
4．将经过计数的细胞悬浮液移入培养板中，使盖玻片完全浸在培养液中；
5．将培养板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，当贴壁细胞生长至覆盖培养板底部2/3面积时，将培养板取出，用盖片镊轻轻取出盖玻
片，用蒸馏水漂洗后即可进行快速固定以及免疫细胞化学检测。
实验要点及说明 ：
1．本方法适用于贴壁细胞培养，而不适用于悬浮细胞培养，悬浮细胞可使用滴片法；
2．所使用的盖玻片应该为优质玻璃制造，并经过铬酸洗液处理；
3．盖玻片非常薄，易碎，取放盖玻片时动作要轻；
4．如果需要更多生长状态一致的细胞，可以使用较大的培养皿，但不宜过大，以避免培养液的浪费和增加污染机率；
5．如果细胞贴壁生长能力较差，可将盖玻片在0.5%多聚赖氨酸溶液中浸泡5-10分钟并自然晾干。
贴壁培养的优点：
容易更换培养液；细胞紧密黏附于固相表面，可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养液。
容易采用灌注培养，从而达到提高细胞密度的目的；因细胞固定表面，不需过滤系统。
当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有效的表达一种产品。
同一设备可采用不同的培养液/细胞的比例。
适用于所有类型细胞。
贴壁培养的缺点：与悬浮培养法相比
扩大培养比较困难，投资大；
占地面积大；
不能有效监测细胞的生长；
原代培养有两种
组织块培养法：
1）将上述剪好的小块放入15ml离心管中用10ml的Hanks洗液强有力的反复吹打,1000转离 心1分钟,弃去上清,重复一次.
2）用习惯将组织块放入25cm2 培养瓶中,竖起培养瓶,加入1-2ml培养液,培养箱中将培养瓶底朝上,放置2-4小时,小心将培养瓶方正,继续培养.
3）培养3-4小时后缓慢取出培养瓶,加5ml培养液,继续培养.
4）三天后小心取出观察,搜集漂浮组织块,置入离心管中,400转离心3分钟,弃去三分之二 上清,补加5ml培养液,移入25cm2 培养瓶中继续培养.
消化培养法：
1）将上述剪好的小块放入15ml离心管中,加入5-10ml的IV胶原酶消化液,放入37℃水浴中不断震荡,联系观察一小时,直至组织块弥散开为止,每隔30分钟收集消化液.
2）400转离心4分钟,收集细胞沉淀,用Hanks洗液冲洗,并重复一次.
3）将收集的细胞沉淀,用培养液重悬,置于4°冰箱,直至消化全部结束.
4）将细胞悬液通过250目不锈钢钢筛,将滤液置于25cm2 培养瓶中,放入培养箱培养.
答：用超声的办法也可以把细胞分离下来，但是要注意超声的频率不能太大，而且细胞很娇嫩，超声会导致细胞的破裂。培养细胞有3种状态：贴壁、半贴壁、悬浮。对于贴壁生长的细胞来说，如果培养过程中发现细胞悬浮，则说明细胞生长不好或者死亡。对于另两类细胞来说，悬浮没什么不可以。 细胞贴壁生长时细胞生长的...
答：原代动物细胞培养：1、实验材料要新鲜，从活体分离材料后要低温保存，并尽快进行细胞分离实验。2、无菌操作。操作时用的培养液，可加平时细胞培养液5倍含量的青链霉素。3、用酶法分离细胞时，注意酶液的浓度和控制消化时间。贴块法分离细胞时，注意动作要轻柔，不要伤到细胞组织，组织块边缘尽量平整有...
答：细胞就会停止分裂增殖）。怎么办呢？这时可以再用胰蛋白酶处理细胞群，使贴壁细胞群分散，便于继续培养。从10-50代叫做传代培养，那么10-50代的细胞叫做细胞株，50代以后有的细胞发生突变，形成肿瘤细胞，能无限增殖，叫做细胞系。。ps：动物细胞培养只能培养成细胞团，而不能培养成为完整的个体噢。
答：3.4 37℃,5% CO2 培养箱培养2 天; 3.5 收集悬浮细胞及疏松贴壁生长的细胞即为成熟树突状细胞。 【BMDC 大量制备法】-Son 法 背景: 1. 该法可在7 天内获得30-40 x 106 个DC/小鼠,是Inaba 经典方法的7-10 倍。DC经14.5%甲泛葡胺(Metrizamide)梯度离心后,纯度(即CD11c+/I-Ab+细胞)可达85-95%。
答：动物细胞与微生物细胞有很大的差异,对体外培养有严格的要求,如动物细胞对剪切非常敏感,反应器的选择不能有像微生物细胞那样高的剪切力,因此,传统的微生物细胞生物反应器应该经过改造才能适用动物生物反应器.动物细胞培养分为三种类型,一类是悬浮培养,指细胞在培养器中自有悬浮生长的过程,要勇于非贴壁依赖性...
答：计算细胞密度和存活率。6. 细胞接种：将细胞接种至30ml的培养瓶中，每瓶6×105，用含15%小牛血清的DMEM培养液培养。7. 培养：5%CO2、37℃培养箱培养12h，显微镜下可见细胞贴壁，呈多角形，培养24h，镜下见细胞已连结在一起，部分细胞开始搏动。8. 换液：培养3～5d，细胞换液。
答：培养的动物细胞大都取自动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，将组织取出来后，先用胰蛋白酶等使组织分散成单个细胞，然后配制成一定浓度的细胞悬浮液，再将该悬浮液放入培养瓶中，在培养箱中培养，这个过程称为原代培养。细胞在培养瓶中贴壁生长。随着细胞的生长和增殖，培养瓶中的细胞越来越多，...
答：来源于血液、淋巴组织的细胞，及许多肿瘤细胞（包括杂交瘤细胞）和某些转化细胞等属于悬浮培养型细胞，细胞为非贴壁依赖性细胞，无需支撑面，细胞或细胞聚集体悬浮于液体培养基中增殖。悬浮培养是大规模细胞培养的理想方式，可采用类似于微生物的方法进行悬浮培养。动物细胞较微生物脆弱，易受剪切力等的影响...
答：附：1用途：指动物、(包括哺乳动物、昆虫、鱼类、禽类等)细胞在体外的培养技术，即在无菌条件下，从机体中取出组织或细胞，模拟体内正常生理状态下生存的基本条件，让它在培养器皿中继续生存、生长和繁殖的方法。体外培养的细胞可分为原代细胞和传代细胞。动物细胞培养给细胞生物学的研究带来了极大的方便，...
答：传代培养可获得大量供实验所需细胞。细胞传代要在严格的无菌条件下进行，每一步都需要认真仔细地无菌操作。培养的细胞为癌变或人为癌化的细胞，理论上可以无限增殖。癌化的方式有很多：进行癌基因突变，感染病毒，从癌症供体体内分离，物理或化学方法（如紫外，化学试剂）等。2 根据培养方式：贴壁细胞培养，...
