使用葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导溃疡性结肠炎模型时，如何确定浓度？
Establishment of dextran sulfate sodium�induced ulcerative colitis model in rats
ZHAO Ping, DONG Lei, LUO Jin�Yan, MA Hui, GUAN Hai�Tao, SHANG He�Ling
1Department of Gastroenterology, 2Department of Oncosurgery, Second Hospital, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, China, 3Tangyu Convalescent Hospital, Lantian 710516, China
【Abstract】 AIM: To establish the rat model of ulcerative colitis (UC). METHODS: The rats were first given 40 g/L dextran sulfate sodium (DSS) in drinking water for 7 d and then given only water for 10 d. The disease activity index (DAI) of all the rats was evaluated daily. The rats were killed on day 8, 13 and 18 and the lesion score and histological score of colon were evaluated. Segments of distal colon were adequately prepared for transmission electron microscopic observations. The weight index of cecum, colon, thymus and spleen were calculated and the myeloperoxidase (MPO) activity of rectum was measured. RESULTS: Rats receiving 40 g/L DSS solution for 7 d developed diarrhea and positive fecal occult blood. Inflammation of colon mainly involved the mucous membrane and submucosa. Focal erosions of the epithelium, goblet cells depletion, destruction of crypt and neutrophil infiltration were observed. The increase of MPO activity 〔(8.84±3.67) nkat/g tissue vs (127.19±27.84) nkat/g tissue, P<0.01〕 and weight of spleen 〔(3.45±1.00) mg/g vs (5.07±1.31) mg/g, P<0.05〕 was also observed. After replacing the DSS solution with water, the symptoms and colonic pathological changes of rats were gradually disappeared and the MPO activity significantly decreased（P<0.05）. CONCLUSION: This colitis model in rats appears to share nearly all the morphological characteristics with human UC.
【Keywords】 disease models, animal; colitis, ulcerative; dextra sulfate sodium
【摘要】 目的: 建立大鼠溃疡性结肠炎（UC）模型. 方法： 给SD大鼠饮用40 g/L DSS溶液7 d，然后改正常饮水10 d. 每日进行疾病活动指数(DAI)评分. 于实验8,13和18 d分别处死4～5只，行组织学大体评分、组织病理评分及透射电镜观察. 计算盲肠、回盲部至肛门段结肠、胸腺、脾脏质量指数并测直肠髓过氧化物酶（MPO）含量. 结果：大鼠饮用40 g/L的DSS 7 d均出现腹泻、隐血试验阳性. 可见炎症主要累及黏膜和黏膜下层，部分表面上皮脱落，上皮内杯状细胞减少，隐窝破坏，浸润的炎症细胞以中性粒细胞为主. 伴有MPO升高〔(8.84±3.67) nkat/g vs (127.19±27.84) nkat/g, P<0.01〕及脾脏增大〔(3.45±1.00) mg/g vs (5.07±1.31) mg/g, P<0.05〕. 停药后症状及结肠病变逐渐恢复， MPO活性显著降低（P<0.05）. 结论：此模型病理改变类似人UC.
【关键词】 疾病模型，动物；结肠炎，溃疡性；葡聚糖硫酸钠
0引言
溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）在我国的发病率逐渐增高. 其确切的病因和发病机制至今尚不完全清楚,缺乏有效的根治方法. 因此建立UC动物模型,对研究UC的病因、病理机制及新药开发具有重要意义. 葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)诱导的UC动物模型与人类UC的病理形态极为近似，但不同物种及不同浓度DSS所诱导的UC的病变特征不同. 我们选用SD大鼠建立UC动物模型，并观察该模型不同时期的症状、病理等改变如下.
1材料和方法
1.1材料
健康雄性SD大鼠26只，体质量180～200 g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供. 葡聚糖硫酸钠Sigma公司生产,Mr 5000,硫磺含量150～200 g/kg. 髓过氧化物酶（myeloperoxidas，MPO）检测试剂盒购自南京建成生物研究所. H�600透射式电子显微镜由日本日立公司生产.
1.2方法
大鼠随机分为DSS模型组（n=20）和正常对照组（n=5），DSS模型组饮用40 g/L DSS溶液7 d诱发急性结肠炎,然后改正常饮水10 d. 正常对照组大鼠正常饮水. DSS模型组每日记录大鼠体质量、大便性状、隐性或显性出血情况, 进行疾病活动指数(DAI)评分〔1〕. 于实验8（n=5）, 13（n=5）和18 d（n=4）用200 g/L乌拉坦7 mL/kg ip麻醉，剖腹观察结肠外观，延系膜侧剖开结肠，行组织学大体评分〔2〕. 取盲肠、回盲部至肛门段结肠、胸腺、脾脏称质量，计算体质量指数. 取升结肠、横结肠、远段结肠各1.5 cm,用40 g/L甲醛溶液固定,切片,HE染色，行组织病理评分〔3〕. 取距肛门3 cm处直肠黏膜行透射电镜观察. 称取直肠黏膜100 mg，-80℃保存，按MPO试剂盒说明进行检测.
统计学处理： 使用SPSS 10.0软件行统计学处理. 数据以x±s表示，采用One�way ANOVA分析. P<0.05为差异有显著性.
2结果
大鼠饮用40 g/L DSS 3~7 d出现急性结肠炎症状，腹泻、隐血试验阳性最早于3 d出现，肉眼血便最早于4 d出现. 动物体质量明显下降， 5 d除血便极轻的2只大鼠体质量稍增加和1只大鼠明显增加外，其余17只体质量仍减轻. 饮用DSS过程中大鼠出现毛发色泽灰暗,精神萎靡,食量下降等. 停药后1～2 d，腹泻、血便迅速好转. 模型组DAI值由2 d的0.56±0.41迅速升至7 d的2.04±0.77，差异有显著性（P<0.01）. 7～9 d死亡6只，1只死于肠坏死，1只死于衰竭，4只死于肠道出血. 实验8 d见大肠缩短，肠壁明显增厚,管壁僵硬，肠黏膜广泛充血、水肿，局部有糜烂、出血，可见明显溃疡面. 病变以回盲部及远段结肠为重. 远段结肠的不规则溃疡及糜烂多见于距肛门缘3～4 cm内,病变自下向上逐渐减轻. 实验13 d，结肠病变有所恢复，仍有局部充血、水肿和溃疡. 实验18 d，结肠病变基本恢复，溃疡愈合，仍有局部充血、水肿，结肠损伤评分较8 d显著减低（P<0.01,Tab 1）.表1DSS所致结肠炎恢复过程中结肠损伤及组织损伤评分（略）
2.1组织病理改变实验8 d越近肛门侧病理改变越明显，与肉眼观察一致. 光镜下可见炎症主要累及黏膜、黏膜下层，部分表面上皮脱落，上皮内杯状细胞减少，隐窝破坏，浸润的炎症细胞以中性粒细胞为主,符合急性炎症的组织病理改变（Fig 1A）. 实验13 d，光镜下可见较局限的隐窝破坏伴上皮再生修复及腺体增生，隐窝变形、排列紊乱. 实验18 d，黏膜基本恢复正常，仍有少量炎细胞浸润. 升结肠、横结肠组织损伤评分各时间段差异无显著性(Tab 1). 电镜观察发现正常对照组结肠上皮细胞微绒毛完整，细胞连接和细胞器未见损伤，杯状细胞分泌旺盛. DSS模型组结肠上皮细胞有坏死脱落，细胞受损严重，表现为微绒毛稀疏、紊乱、断裂乃至脱落，线粒体肿胀，粗面内质网扩张，核染色体边集明显. 杯状细胞明显减少，残留的杯状细胞水肿明显，线粒体肿胀、嵴突减少、嵴断裂，内质网扩张（Fig 1B）.
2.2脏器体质量指数和MPO活性改变实验7 d后，盲肠、结肠、脾脏体质量指数显著增加，停药后逐渐恢复（Tab 2）. 在DSS致大鼠急性肠炎过程中胸腺体质量指数无明显变化. 实验7 d后，MPO活性显著升高，停药5 d后显著降低（Tab 2）.表2DSS结肠炎恢复过程中脏器体质量指数及MPO活性（略）
3讨论
大鼠饮用40 g/L DSS 7 d均出现急性结肠炎症状，腹泻、隐血试验阳性最早于3 d出现，肉眼血便最早于4 d出现. 大体观察见肠壁明显增厚，管壁僵硬，肠黏膜广泛充血、水肿，局部有糜烂、出血，可见明显溃 疡面. 病变以盲肠及远段结肠为重. 光镜下可见炎症主要累及黏膜、黏膜下层，部分表面上皮脱落，上皮内杯状细胞减少，隐窝破坏，浸润的炎症细胞以中性粒细胞为主,符合急性炎症的组织病理改变. 这些改变与人类的UC相似〔1,2〕. DSS致大鼠UC模型简便易行，让实验动物自由饮用DSS配成水溶液即可，重复性好,成模率达100%，成功率高. 以往研究表明，人为反复运用DSS刺激，可诱导大鼠出现类似人类的急性期和缓解期交替出现的变化，与人类病变、病程相似〔1〕. 因此，DSS致大鼠UC模型是较为成功的UC动物模型. 我们观察到单次给DSS，停药后结肠病变逐渐好转，至停药后10 d，结肠病变基本恢复，溃疡愈合，仅有局部充血、水肿. 故如应用该模型进行药物干预治疗，应注意治疗时机的选择.
DSS诱导大鼠结肠炎模型与人类UC的症状及病理改变均相似. 该模型制作简单、重复性好，除可用于UC发病机制的研究外，还可用于开发新型UC治疗药物的研究，如黏膜保护剂、抗TNF抗体〔3,4〕等有潜在治疗作用的药物.
【参考文献】
〔1〕 Osman N, Adawi D, Ahrne S, et al. Modulation of the effect of dextran sulfate sodium�induced acute colitis by the administration of different probiotic strains of Lactobacillus and Bifidobacterium〔J〕. Dig Dis Sci, 2004;49(2):320-327.
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〔3〕 Iba Y, Sugimoto Y, Kamei C, et al. Possible role of mucosal mast cells in the recovery process of colitis induced by dextran sulfate sodium in rats 〔J〕. Int Immunopharmacol, 2003; 3(4): 485-491.
〔4〕 Murakami A, Hayashi R, Takana T, et al. Suppression of dextran sodium sulfate�induced colitis in mice by zerumbone, a subtropical ginger sesquiterpene, and nimesulide: Separately and in combination 〔J〕. Biochem Pharmacol, 2003; 66(7): 1253-1261.
柏龄肠结宁新茶这药治疗肠炎很管用的，用上方便而且还便宜，是治疗肠炎的好药，希望有肠炎的朋友能够早点好起来。
DSS适合的浓度：DSS适合的浓度是一个区间范围值，以往文献在2%-5%之间多；
建议第一次做实验的时候建议3%，一个循环后看情况＋或-0.5%。
同时建议在正式实验开始前做预实验来确定实际诱导浓度。
不同批次的DSS使用浓度会有差异：
DSS是葡聚糖聚合物，分子量是平均分子量，每个批次之间会有分子量的差异，而分子量对肠炎造模有影响。通常DSS批间差比较稳定，但是也有少部分批次存在批间差较大的现象，建议客户根据自己实验需求，购买足够的同一批次产品。
诱导急性结肠炎模型的Protocol：选取成年动物正常饲养1-2周→2-5%DSS自由饮5-7天观察症状体征。
诱导慢性结肠炎模型的Protocol：选取成年动物正常饲养1-2周→2-3%DSS自由饮5-7天观察症状体征→停止饮用DSS，改正常饮水7-14天→重复2-3%DSS自由饮5-7天观察症状体征→重复停止饮用DSS，改正常饮水7-14天。
答：Liu等利用偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠(AOM/DSS)小鼠模型和IL-6诱导的结直肠癌细胞系(CT26)研究了TPS对CaC的抗肿瘤作用,结果表明TPS能够通过平衡细胞微环境,显著降低肿瘤发生率和肿瘤大小,并显著抑制促炎细胞的浸润和促炎细胞因子的分泌。Gao等通过研究中茶108中茶多绿茶多糖抑制肿瘤生长的具体机理为促进巨噬细胞、淋巴细胞...
答：大约每升家蚕血淋巴中可以获得192毫克重组人乳铁蛋白。重组人乳铁蛋白表达量在感染重组病毒120小时后达到最大，随后迅速降低。体内生物活性研究了重组人乳铁蛋白对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠急性结肠炎的预防作用。研究结果表明重组人乳铁蛋白可以显著的抑制DSS诱导的结肠炎症状，这为重组人乳铁蛋 ...
答：多糖的分子量测定常用的是凝胶滤过法。将充分膨胀好的SephadexG-200、G-150或G-75湿法装柱，用一定离子强度的氯化钠水溶液进行平衡，然后将各种不同的已知分子量的多糖分别相继上柱，同一离子强度的氯化钠水溶液洗脱，分步收集，苯酚-硫酸法监测，分别求得洗脱体积Ve，然后再将兰葡聚糖（MV>200万）上同...
答：b、沉淀葡聚糖：准确吸取b项终溶液2mL置于20mL离心管中，加入100g/L氢氧化钠溶液2.0mL铜试剂溶液2.0mL，沸水浴中煮沸2min，冷却，以3000r/min离心5min，弃去上清液。残渣用洗涤液数毫升洗涤，离心后弃去上清液，反复操作3次，残渣用10%（体积分数）硫酸溶液2.0mL溶液并转移至50mL容量瓶中，加水稀释...
答：13、目的用HPLC法鉴别白头翁汤。 14、为了解白头翁提取物杀菌效果，进行了悬液定量杀菌实验。 16、其中，堇菜科紫花地丁、鸢尾科的细叶鸢尾、毛茛科的白头翁等具有较高的观赏价值，可进一步引种栽培。 17、说明“复方白头翁口服液”有加强机体的非特异性免疫作用，提高动物的非特异免疫功能。
答：丁酸与肠道黏膜和肠炎大量动物实验和人体临床研究表明, 丁酸在修复肠黏膜和治疗肠炎时发挥重要作用. 经葡聚糖硫酸钠(DSS)处理后, 急性结肠炎小鼠结肠内丁酸吸收减少, 导致黏膜的完整性受到破坏. DSS诱发结肠炎的早期, 黏膜通透性就开始增加, 并伴随细胞存活率的下降和组织学的变化. 而丁酸能够逆转黏膜...
答：丁酸的医学用途：在药剂制造中用作矫味剂；丁酸的钙盐在冷水中比在热水中的溶解度大，故还可用作成盐剂，以增加药物的溶解度。还可用于γ-氨基丁酸等医药中间体的制备。正丁酸是一种重要的合成香料以及其他精细化工产品的原料，主要用于丁酸酯类和纤维素丁酸酯的合成。丁酸酯类各具不同的水果香味，在...
