请教ANNEXIN V-PI法检测凋亡的原理和相关试剂盒使用步骤
博凌科为生物科技-为你解答：一、原理在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依 赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素（EGFP、FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。二、常见试剂盒组份 组份 Annexin V-FITC 50L 100L 250L 500L Binding Buffer 5 mL 10.0 mL 25 mL 25 mL2 Propidium Iodide （PI） 50L 100L 250L 500L 三、操作步骤1.悬浮细胞离心（2000rpm离心5min）收集；贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化收集（注：胰酶消化时间不易过长，否则容易引起假阳性）；2.用PBS洗涤细胞二次（2000rpm离心5min）收集1~5105细胞；3.加入500L的Binding Buffer悬浮细胞；4.加入5L Annexin V-FITC混匀后，加入5L Propidium Iodide，混匀；5.室温、避光、反应5～15min；6.请在1 hour内，进行下述荧光显微镜或流式细胞仪的观察和检测。A.荧光显微镜观察1.滴一滴上述染色后的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞；2.对于贴壁细胞来说，也可直接用盖玻片来培养细胞并诱导细胞凋亡；（1） 将细胞于盖玻片上生长，用适当的凋亡诱导剂诱导细胞凋亡，并设立阴性对照组；（2） 用PBS洗涤细胞两次；（3） 在500L 的Binding Buffer中加入2L Annexin V-FITC， 5L Propidium Iodide，混匀；（4） 将上述溶液滴加于盖玻片表面，使长有细胞的盖玻片表面均匀覆盖；（5） 避光、室温反应5 min。3.将盖玻片倒置于载玻片上，于荧光显微镜下、双色滤光片（FITC和罗丹明）观察Annexin V-FITC荧光信号呈绿色，PI荧光信号呈红色。B.流式细胞仪分析用流式细胞仪检测，激发波长Ex=488 nm; 发射波长Em=530 nm。荧光补偿调节：使用未经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。四、注意事项1.Annexin V-FITC，Propidium Iodide （PI）避光保存及使用。2.Propidium Iodide （PI）有毒，操作时要戴手套。3.本试剂盒适用于检测活细胞，流式细胞仪检测时，细胞数量不以应低于1105，，不适用于检测组织样本。4.推荐使用悬浮培养细胞，如果是贴壁细胞，用胰酶消化不当，会引起假阳性，而用细胞刮子会造成细胞粘连成团，而影响检测。可将胰酶消化后细胞的保存在含2%BSA的PBS中，防止进一步的损伤。5.因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此建议每次检测均需使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节。五、储存 置于40C，可保存一年
是的，要注意不要消化过度
有关Annexin -PI凋亡细胞的检测使用的是BIODAI的较多，具体的步骤如下：1) 悬浮细胞：300g，4℃，离心5min，收集细胞。贴壁细胞：用不含EDTA的胰酶消化后，300g，4℃，离心5min，收集细胞。胰酶消化时间不宜过长(见注意事项)，以防引起假阳性。2) 用预冷的PBS洗涤细胞两次，每次均在300g，4°C离心5min，收集1-5×105细胞。注意:在洗涤细胞时，尽量避免损伤细胞。3) 加入100µl 1×Binding Buffer重悬细胞。4) 加入5µl Annexin V-FITC和5µl PI，轻轻混匀。 5) 避光、室温反应10 min。6) 加入400µl 1 x Binding Buffer，混匀，样品在1小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测。Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit）是用FITC标记了的Annexin V作为探针，来检测细胞早期凋亡的发生，可用荧光显微镜、流式细胞仪或其他荧光检测设备进行检测。
其检测原理为：在正常的活细胞中，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，但在早期凋亡的细胞中，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-Ⅴ（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。
操作步骤：
1. 从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2. 设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；
3. 样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。
4. 除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6. 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7. 每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
