m6A都有哪些相关验证实验？来看一下吧
完整的实验离不开后续的验证。 话不多说，接下来我们就细数一下 MeRIP-seq ，都有哪些相关的 验证实验 吧~
首先，如果需要对m6A修饰位点进行严格的验证，可以用下面这个方法：
m6A-IP-qPCR ，也叫MeRIP-qPCR，即 m6A抗体富集到带甲基化修饰的RNA，下一步使用qPCR直接对富集到的RNA进行定量 的一种技术。
m6A修饰的过程，离不开 甲基转移酶（writer）、去甲基转移酶（eraser）和阅读蛋白（reader） 的作用。如下图，展示了与m6A修饰作用相关的 各种RNA结合蛋白 ：
所以， RNA-蛋白质 、 蛋白-蛋白互作 ，也是MeRIP-seq后续实验验证关注点，那么让我们看看验证RNA与蛋白以及蛋白质之间相互作用的实验有哪些吧~
主要是用来研究体内 RNA与蛋白结合 情况。比如，检测 reader蛋白与RNA 的具体结合情况。
该方法具体是利用 针对目标蛋白的抗体 把相应的 RNA-蛋白复合物沉淀 下来，通过 分离纯化 ，对结合在复合物上的RNA 进行 RT-PCR验证或测序分析 ，了解转录后调控网络动态过程。
（METTL3 facilitates tumor progression via an m6A-IGF2BP2-dependent mechanism in colorectal carcinoma. Molecular cancer, 2019）
研究 RNA与蛋白质互作 的一种技术。利用 生物素标记的RNA探针 ，通过与含有目的蛋白的溶液孵育，形成 RNA-蛋白质复合物 。复合物可以特异性结合磁珠，从而与孵育液中的其他蛋白分离。复合物洗脱后，通过 蛋白凝胶电泳实验 ，检测特定的RNA与蛋白的结合情况。
（METTL3 facilitates tumor progression via an m6A-IGF2BP2-dependent mechanism in colorectal carcinoma. Molecular cancer, 2019）
体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用，用于验证 两个已知蛋白的相互作用 ，或者 筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白 。
该实验基于 GST（glutathione-S-transferase），即谷胱甘肽-S-转移酶蛋白 ，可以与谷胱甘肽（Glutathione，GSH）结合。
将GSH固定于琼脂糖珠上，形成GSH-琼脂糖珠，将已知蛋白X与GST融合表达，获得的GST-X可与GSH-琼脂糖珠结合，若环境中存在与X蛋白互做的蛋白Y，则会形成 “琼脂糖珠-GSH-GST-X-Y”复合物 ，与X蛋白互做的蛋白即可被分离并检测。
（Sec62 promotes stemness and chemoresistance of human colorectal cancer through activating Wnt/β-catenin pathway. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research . 2021）
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多 蛋白质-蛋白质间的相互作用 被保留了下来。
如果用蛋白质A（图中红色方块）的抗体免疫沉淀A，那么与A在体内结合的蛋白质B（图中黑色方块）也能沉淀下来。 若B为已知蛋白，用WB验证A和B互作；若B为未知蛋白，用质谱可知与A互作的蛋白。
（METTL14 regulates M6A methylation-modified primary miR-19a to promote cardiovascular endothelial cell proliferation and invasion. Eur Rev Med Pharmacol Sci 2020）
已知m6A修饰会影响 RNA的翻译效率 。 Ribosome profiling sequencing（Ribo-seq)） ，是针对核糖体结合的RNA进行测序。
该方法富集 与核糖体结合的正在翻译的RNA ，然后通过测序对富集的RNA进行定量，从而实现 对翻译强度进行定量 。
（1、N(6)-methyladenosine Modulates Messenger RNA Translation Efficiency. Cell. 2015 Jun；
2、Ribosome Profiling: Global Views of Translation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2018 July ）
检测RNA半衰期的方法有很多。比如，可以 利用转录抑制剂放线菌素D抑制细胞内基因转录后 ，在不同时间点收集总RNA，然后做 Northern或者RT-PCR ，比较不同时间点mRNA丰度的变化。如下图，Boxuan Simen Zhao.在“Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications”一文中通过半衰期讲述m6A修饰对mRNA稳定性的影响。
除了一系列的分子生物学上的验证，当然也少不了细胞水平和动物模型方面的实验，接下来也顺便简单了解一下吧![图片]
通常实验过程中，要证明某基因在细胞中行使什么样的功能，可以利用 质粒及慢病毒等载体 ，在细胞中对该基因进行 敲低（knockdown）、敲除（knockout） 或过 表达（overexpression） ，然后再通过 RNA-seq、免疫荧光、细胞表型（迁移、侵袭、增殖、凋亡、周期）实验 等，说明该基因在细胞内环境中行使的功能。
（1. Zhao W et al. METTL3 Facilitates Oral Squamous Cell Carcinoma Tumorigenesis by Enhancing c-Myc Stability via YTHDF1-Mediated m6A Modification. Mol Ther Nucleic Acids. 2020；
2. N6-Methyladenosine METTL3 Modulates the Proliferation and Apoptosis of Lens Epithelial Cells in Diabetic Cataract. Mol Ther Nucleic Acids. 2020）
是指各种医学科学研究中建立的具有人类疾病模拟表现的动物，可分为自发性动物模型和诱发性动物模型。
动物疾病模型，主要用于实验生理学、实验病理学和实验治疗学（包括新药筛选）研究，涵盖动物 病理解剖、HE染色、免疫组织化学检测 等。
（1. RNA N6-methyladenosine methyltransferase-like 3 promotes liver cancer progression through YTHDF2-dependent posttranional silencing of SOCS2.Hepatology. 2018 Jun；
2. Anti-tumour immunity controlled through mRNA m6A methylation and YTHDF1 in dendritic cells. Nature. 2019 Feb）
答：此外，研究还验证了HNF1A-AS1通过抑制PDCD4或与miR-93-5p竞争性结合，以及通过METTL3介导的m6A修饰来调节CCND1的表达。这一发现提示，HNF1A-AS1可能作为结直肠癌的潜在预后标志，为早期诊断和治疗提供了新线索。类器官培养方面，模基生物提供的相关产品如小鼠结肠类器官小肠套装和结直肠癌类器官培养基套装...
答：通过生物信息学工具预测，研究者发现LncRNA KB-1980E6.3可能与RNA结合蛋白IGF2BP1相互作用，进而调控c-Myc mRNA的稳定性。实验验证了这一假设，揭示了LncRNA KB-1980E6.3通过与m6A读取器IGF2BP1结合来增加c-Myc mRNA的稳定性。5. LncRNA KB-1980E6.3在肿瘤发生中的作用 研究进一步探讨了LncRNA KB...
答：南京农业大学园艺学院张绍玲教授实验室研究了N6-甲基腺苷酸（m6A）在蔷薇科植物生长和抗逆性中的作用。研究鉴定了蔷薇科植物中的m6A写入器、读取器和擦除器，并推断它们的扩展和进化历史。研究发现m6A是调控植物发育和抗性的重要因子，PbrMTA1沉默的梨植株耐旱性和叶绿素含量显著降低，电解质渗漏以及丙二醛和...
答：那么各组学筛选的标记物实验验证的方法有哪些?我本期将给大家奉上多种组学的标记物实验验证方法,供大家参考。 Suorce: Pubmed 为了方便大家快速理解,我查阅大量资料以文字加图片的形式板块化呈现常见的各组学方案及简明实验步骤,本期分享基因组学、蛋白组学、代谢组学以及转录组学4个组学的标记物检测方法,废话少说...
答：wb实验研究蛋白层面的相对变化，或者是进行质谱分析。当然如果还想深入的研究，也可以在细胞功能层面去研究外泌体等信息，通过测序或者细胞功能实验等都是可以的。从此看出研究一个基因的方法还是很多的，从上游到下游，都有非常成熟的技术加一辅助，但期间最重要的是我们的前期调研以及合适的实验方案，实验...
答：两种策略在实验技术上有部分重叠，但也有各自独特的实验技术需求或数据分析策略。 不同策略适应于不同的课题和实验室背景，在选择的时候可以根据课题特点和实验室技术体系进行取舍。当然，两种策略也可以同时应用，相得益彰，相互作证，起到更好验证效果。插入我十分珍藏的一张RNA之间的互作关系来收尾 再...
答：接着对 T.reesei 转化子进行了 PCR,Southern验证和PAGE 分析,实验结果表明基因缺失菌株构建成功,其中 Δcbh1和Δcbh1Δcbh2菌株已不含有原先转入的筛选标记基因。菌株培养物上清液PAGE电泳分析:cbh1缺失菌株Δcbh1外切葡聚糖酶I的量与出发菌株相比明显下降,而外切葡聚糖酶II的分泌量有所提高;cbh2缺失菌株Δcbh2...
