杆状病毒表达系统的杆状病毒

细胞的培养
细胞的生长需要一定的营养环境，用于维持细胞生长的营养基质称为培养基。培养基按其物理状态可分为液体培养基和固体培养基。液体培养基用于大规模的工业生产以及生理代谢等基本理论的研究工作。液体培养基中加入一定的凝固剂(如琼脂)或固体培养物(如麸皮、大米等)便成为固体培养基。固体培养基为细胞的生长提供了一个营养及通气的表面，在这样一个营养表面上生产的细胞可形成单个菌落。因此，固体培养基在细胞的分离、鉴定、计数等方面起着相当重要的作用。从多细胞生物中分离所需要细胞和扩增获得的细胞以及对细胞进行体外改造，观察，必须首先解决细胞离体培养问题，同微生物细胞培养的难易相比，比较困难的是来自多细胞生物的单细胞培养，特别是动物细胞的培养。
设施器材

设施：净化工作台、恒温培养箱、倒置显微镜、液氮储存罐、电热鼓风干燥箱、冰柜、电子天平、恒温水浴箱、离心机、压力蒸汽消毒器。
器材：
一、玻璃器材
无菌室
培养皿、滴流瓶、刻读吸管、离心管、培养瓶、烧杯、量筒、三角烧瓶
二、塑料器材
多孔培养板、培养皿、培养瓶
三、橡皮器材
橡皮制品(最好是硅制品)做各种瓶或试管的塞子、盖子。
四、金属器材
剪刀、镊子、手术刀、解剖刀、血管钳、组织镊、眼科镊及各种型号针头
五、其他物品
纱布、注射器和针头
培养基

(一)简介
细胞的生长需要一定的营养环境，用于维持细胞生长的营养基质称为培养基。培养基按其物理状态可分为液体培养基和固体培养基。液体培养基用于大规模的工业生产以及生理代谢等基本理论的研究工作。液体培养基中加入一定的凝固剂(如琼脂)或固体培养物(如麸皮、大米等)便成为固体培
培养基
养基。固体培养基为细胞的生长提供了一个营养及通气的表面，在这样一个营养表面上生产的细胞可形成单个菌落。因此，固体培养基在细胞的分离、鉴定、计数等方面起着相当重要的作用。从多细胞生物中分离所需要细胞和扩增获得的细胞以及对细胞进行体外改造，观察，必须首先解决细胞离体培养问题，同微生物细胞培养的难易相比，比较困难的是来自多细胞生物的单细胞培养，特别是动物细胞的培养。
(二)几种常用溶液的配制方法
1、无钙、镁、离子溶液(1000ml)
氯化钠(NaCl)8g磷酸二氢钠、(NaH2PO4H20)0.05g、氯化钾(KCl)0.2g、碳酸氢钠(NaHCO3)1g、柠檬酸三钠(Na3C6H5O7,H20)1g、葡萄糖1g、加去离子水或双蒸水至1000mL
2、磷酸盐缓冲液
甲液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液、磷酸氢二钠(无水)28.4g、氯化钠8.77g加去离子水或双蒸水至1000mL
乙液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液、磷酸二氢钠(无水)2.4g、氯化钠8.77g加去离子水或双蒸水至1000mL
甲、乙液于4℃保存，使用时按表3-2所示比例，配制成所需pH浓度，高压灭菌后室温保存。
3、Hanks液
(1)母液甲(20x)配法
①NaCl(A.R)160g、KCl(A.R)8g、MgSO4.7H2O（A.R)2g、MgCl.6H2O(A.R)2g依次溶于800mL双蒸水中，前一物质溶后再加后一种。
②CaCl2(A.R)2.8g溶于100mL双蒸水中，溶时不断搅拌（此液应单配，单溶）。
待上述两溶液中的“溶质”全溶后，将它们混合，再用双蒸水补至1000mL，向其中加2mL氯仿作为防腐剂，置4℃保存。
(2)母液乙(20×)配法
①Na2HPO4.12H2O(A.R)3.04g、KH2PO4(A.R)1.20g、葡萄糖(A.R)20.0g溶于800ml双蒸水中。
②0.4%酚红液0.4g酚红放在玻璃研钵后加0.01N、NaOH11.28mL，直到全部溶解，移入100mL容量瓶中，加水至100mL，过滤，pH为7.4，4℃保存。
待上述各“溶质”完全溶解后，用双蒸水补至1000mL,其中加氯仿2mL作防腐剂，置40℃保存。
3)使用液（1×）配法
取母液甲和母液乙各一份，加双蒸水18份，分装后，塞好瓶塞，挂上标志。以115℃高压灭菌25分钟(以免葡萄糖破坏)，置室温后4℃保存，可使用几个月。临用前，用7.5%NaHCO3调至所需pH。
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细胞培养的一般条件

简言之，既细胞需要什么就提供什么，道理是如此，真正能做到这点尚需时日，人们至今对细胞的生命周期控制机理认识不足，癌细胞虽然也来自正常细胞，但至今不知道究竟为什么癌细胞很难停止已经启动的有害分裂，尽管如此，人们长期的研究结果表明，离体细胞培养需要的基本条件就是下列细胞生理条件。
(1)温度
温度过低时细胞生长缓慢甚至不生长。利用冷冻保藏细胞可保持细胞的原有分裂分化能力。温度过高导致细胞死亡。这主要是由酶和蛋白质所需要的最适温度决定的。多数生物大分子遇到高温后容易导致空间结构改变或者丧失（变性）。细胞膜遇到高温后容易变态。在自然界，即有耐高温的
恒温培养箱
细胞，也有耐低温的细胞。在极端情况下生长的生物对付极端环境的机制研究在生物进化和农业、环保、发酵工业中意义重大。
(2)pH
过酸或过碱可导致细胞死亡。这主要与蛋白质的变性和细胞膜的结构受损有关。
(3)渗透压
细胞内外可溶于水的物质比例和种类决定细胞的膨胀与收缩程度，因为细胞膜是半透膜，只允许对自己有利的物质通过。同一物质在细胞内外的分布的数量不同，当某一种极溶于水的物质在细胞外浓度过大时，有可能导致细胞干瘪死亡，这些物质在细胞内过多时导致细胞过量吸水膨胀。细胞膜调节渗透压的能力是有限的。
(4)营养物
营养物和水一起，又叫细胞培养液，培养液中含有细胞增殖和生长所需要的各种物质。营养物包括：N 源、C源，这些物质与提供能量有关；无机盐、维生素、激素，这些物质与代谢调节控制有关。细胞培养液的设计一直是细胞离体培养技术的关键。理想的细胞培养液可以同时解决细胞离体培养所需要的pH、渗透压、营养物、调节物质的全部需要。在干细胞分化研究与应用中，关键是找到一种使干细胞分化成为所需细胞和组织的营养液。相同的人干细胞，放在不同的营养液中分化培养出人的各种脏器，这个昔日的梦想已经开始成为现实。植物细胞的组织培养技术已经基本完善配套。名贵花卉、中草药、脱毒马铃薯、组织培养莲菜苗等植物细胞与组织培养技术的不断完善，特别是由于组织培养液的商品化已经被广大农民普遍接受。
(5)水
水是细胞需要数量最大的物质，不同的物种、不同部位、不同生长期的细胞含水量差别相当大。干旱植物细胞的含水量高达90%。水的需求量一般随同细胞培养液一起考虑。
(6)无菌条件
体外细胞培养仅仅是对所需的细胞进行培养，但环境中（如空气）有各种其他微生物，必须对所需细胞进行无杂菌的隔离培养。无菌条件是细胞离体培养最基本的条件。
(7)光
植物细胞和少数细菌需要利用光进行光合作用。
(8)气体
动物细胞需要不断供给氧气和排除二氧化碳，植物细胞与此相反。
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动物细胞培养的特殊条件

在所有的细胞离体培养中，最困难的是动物细胞培养。下面是它所需要的特殊条件。
(1)血清：动物细胞离体培养常常需要血清。最常用的是小牛血清。血清提供生长必需因子，如激素、微量元素、矿物质和脂肪。有一天人们真正学会了配制和血清一样的培养液，那时血清才可被取代。在这里，血清等于是动物细胞离体培养的天然营养液。
(2)支持物：大多数动物细胞有贴壁生长的习惯。离体培养常用玻璃，
高速冷冻离心机
塑料等作为支持物。
(3)气体交换：二氧化碳和氧气的比例要在细胞培养过程中不断进行调节，不断维持所需要的气体条件，每一次开箱操作后的快速恢复对设备的要求可想而知有多难？由此决定了动物细胞离体培养设备要求高、投资大。
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植物细胞培养的特殊条件

(1)光照：离体培养的植物细胞对光照条件不甚严格，因为细胞生长所需要的物质主要是靠培养基供给的。但光照不但与光合作用有关，而且与细胞分化有关，例如光周期可对性细胞分化和开花调控作用，所以以获得植株为目的的早期植物细胞培养过程中，光照条件特别重要。以植物细胞离体培养方式获得重要物质，如药物的过程，植物细胞大多是在反应器中悬浮培养。
(2)激素：植物细胞的分裂和生长特别需要植物激素的调节，促进生长的生长素和促进细胞分裂的分裂素是最基本的激素。植物细胞的分裂，生长，分化和个体生长周期都有相应的激素参与调节。和动物细胞相比，植物细胞离体培养对激素要求的原理已经了解，其应用技术也已相当成熟，已经有一套广泛作为商品使用的培养液。同时解决了植物细胞对水、营养物、激素、渗透压、酸碱度、微量元素等的需求。
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微生物细胞培养的特殊条件

微生物多为单细胞生物，野生生存条件比较简单。所以微生物人工培养的条件比动植物细胞简单得多。其中厌氧微生物培养比好氧微生物复杂，因为严格厌氧需要维持二氧化碳等非氧的惰性气体浓度，而好氧微生物则只需要通过不断搅拌提供无菌氧气。微生物对培养条件要求不如动植物细胞那样苛刻，玉米浆、蛋白胨、麦芽汁、酵母膏等成为良好的微生物天然培养基。对于一些特殊微生物的营养条件要求，可以在这些天然培养基的基础上额外添加。
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注意事项

1、实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminarflow)以紫外灯照射30-60分钟灭菌，以70%ethanol擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70%ethanol擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。
2、无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70%ethanol擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。
3、小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。
4、工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少ClassII)。操作过程中，应避免引起aerosol之产生，小心毒性药品，例如DMSO及TPA等，并避免尖锐针头之伤害等。
5、定期检测下列项目：5.1.CO2钢瓶之CO2压力5.2.CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。5.3.无菌操作台内之airflow压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000小时/HEPA)。6.水槽可添加消毒剂(Zephrin1:750)，定期更换水槽的水
6、粉末培养基配制好后(加了血清)，一般在4度尽量不要超过1个月，如在-20度存放时间可长一些，但最好也不要超过3-4个月，可能对于永生化细胞株来说要求不是太高，细胞娇弱，放置时间不宜过长。
7、开紫外线照射台的时候，就将培养基、酶、DHANKS液那到室外让它自然升温。这样40分钟后，温度也升上来了。有很多人将他放到37度水浴锅里加热。一定要注意水浴锅的卫生，有的常年不清洗，里面很脏，容易在外面瓶身上吸附大量细菌。因此用它的也一定要勤换水。从水浴锅那出后，最好找个毛巾擦干上面的水。

昆虫杆状病毒的系统
病毒粒子为杆菌状，两端圆滑，侧边平行，无包膜，一般长度范围60~900nm，大多为130nm，直径30nm，无突起及其他外壳表面结构。
病毒特性

形态学
病毒粒子为杆菌状，两端圆滑，侧边平行，无包膜，一般长度范围60~900nm，大多为130nm，直径30nm，无突起及其他外壳表面结构。[1]?
理化特征
标准沉降常数S（20W）=200S，在氯化铯中的浮力密度为1.31g/cm^3。病毒在pH=6~9，4mol/L的NaCl、100mmol/L的EDTA和硫酸铯存在条件下稳定，在室温下可稳定几星期，不受氯仿、四氯化碳和非离子型去垢剂影响，但对于正丁醇敏感，在53~55℃10min即失去侵染活性。 [1]?
核酸
为单分子开环状dsDNA，长7.5~8.0kb。[1]?
蛋白质
病毒含有一个分子质量35~37kDa的主要结构蛋白，一个次要多肽分子质量从33~39kDa大小不等。[1]?
碳水化合物
病毒不含碳水化合物，但可被高碘酸-席夫（Schiff's）试剂染色。[1]?
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基因组

单分体基因组，含有3个ORF。双链DNA的每条链上特定位点均含有一个带单链序列的缺口。基因组中含有反向重复序列。鸭跖草黄斑驳病毒DNA的3个ORF编码蛋白分别为23kDa、15kDa和216kDa，最大的ORF可能编码多聚蛋白，随后切割成几个功能蛋白，包括一个未知功能蛋白（U）、外壳蛋白和RNA结合蛋白（PB）、天门冬氨酸蛋白酶（PR）、逆转录酶（RT）和RNA酶H（RH）。该属鸭跖草黄斑驳病毒的DNA已测序。[1]?
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抗原特性

病毒是中等免疫原性，一些病毒之间有血清学关系。[1]?
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细胞病理

该属大多数种的病毒粒子存在于寄主植物的所以组织中，病毒只分布在细胞质中，单个或成群不规则分布，粒子分散或者排列成栅栏状，不在内含体或有膜囊泡结构中。[1]?
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生物学

寄主范围
病毒的自然寄主范围很有限，常局限于少数几个特定的植物属，症状为褪绿斑驳。实验寄主也很少，在自然寄主以外的传播常常不能成功。[1]?
传播
该属绝大部分病毒都不能机械传播，或传播很困难。主要通过无性繁殖的寄主植物扩散传播，自然界中多数种由介体粉蚧以半持久方式传播，有些病毒也可以种传或经花粉传播。[1]?
地理分布
世界性分布，主要在热带和亚热带地区，病毒的起源地为东南亚及澳大利亚。[1]?
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分类

该属有12个种和4个暂定种，代表种是鸭跖草黄斑驳病毒，中国尚无报道。[1]?
确定种
共12个种。[1]?
?中文名 学名? 国际基因库登录号码???
亮丝草杆状病毒 ?Aglaonema bacillifrom virus（ABV） -
?香蕉线条病毒 ?Banana streak virus（BSV） ?[AJ002234]
?可可树肿枝病毒 ?Cacao swollen shoot virus（CSSV） ?[L14546]
?美人蕉黄斑驳病毒 ?Canna yellow mottle virus（CaYMV） ?-
?柑橘花叶病毒 ?Citrus mosaic virus（CMBV） ?-
?鸭跖草黄斑驳病毒 ?Commelina yellow mottle virus（ComYMV） ?[X52938]
?薯蓣杆状病毒 ?Dioscorea bacillifrom virus（DBV） ?[X94575-76]
伽蓝菜顶端斑点病毒 ?Kalanchoe top-spotting viurs（KTSV） ?-
?菠萝杆状病毒 ?Pineapple bacillifrom virus（PBV） ?-
?胡椒黄斑驳病毒 ?Piper yellow mottle virus（SRV） ?-
?鹅掌柴环斑病毒 ?Schefflera ringspot virus（SRV） ?-
甘蔗杆状病毒 ? ?Sugarcane bacillifrom virus（SCBV） ?[M89923]
暂定种
共4个种。[1]?
?中文名 学名?
?桃叶珊瑚杆状病毒 ?Aucuba bacillifrom virus（AuBV）
?含羞草杆状病毒 ?Mimosa bacillifrom virus（MBV）
?芋杆状病毒 ?Taro bacillifrom virus（TaBV）
?丝兰杆状病毒 ?Yucca bacillifrom virus（YBV）

杆状病毒表达系统（Baculovirus Expression System, BVES）发展于20世纪80年代初，是目前常用的真核表达系统之一，常用的杆状病毒有AcMNPV和BmNPV[27-31]。尽管杆状病毒在哺乳动物细胞内没有复制的迹象，但他们具有有效转导人肝细胞和一些非肝类细胞系的能力[32-34]。Airenne等[35]通过在杆状病毒的Lac Z基因上游插入一个CMV启动子使得目的蛋白在兔颈动脉外膜细胞获得高效表达，同腺病毒相比更具高效性。此外，利用杆状病毒载体可以使神经细胞在体内和体外都能进行有效转导[36]。通过在目的病毒基因组中插入5~18 kb的杆状病毒DNA，可以使病毒在功能启动子和标记蛋白的辅助下能够稳定转化哺乳动物细胞[37]。
家蚕杆状病毒表达系统（家蚕/ BmNPV表达系统）基于家蚕体内系统适合大规模制备生产外源蛋白，且成本低、方便、高效，而且翻译后加工也与天然蛋白相似的优势[38]，结合杆状病毒的转染与表达特性，以家蚕幼虫和蛹为宿主大量表达目的蛋白，为昆虫杆状病毒表达系统之一。家蚕杆状病毒表达系统具有以下优点：(1)能够对重组蛋白进行转录后加工与修饰，使它们在结构及功能上更接近于天然蛋白，与原核系统相比更能保证蛋白的生物学活性。于涟等[39]利用该系统获得了具有良好免疫原性的传染性法氏囊病病毒的VP2蛋白。尽管昆虫细胞对重组蛋白进行修饰的寡糖种类与哺乳动物细胞不完全一样，对不同目的蛋白的活性会产生不同影响[40]，但目前可以通过构建表达特殊糖基化酶的转基因细胞系来克服[41]；(2) 家蚕杆状病毒具有的多角体启动子在感染病毒的后期成为强启动子，能够引起外源蛋白的大量表达，Higashihashi等[42]通过该系统在家蚕幼虫表达乙肝表面抗原的M蛋白，每只蚕可获得400~500μg的HBsAg，Michiro Muraki等[43]利用该系统表达hFasRECD-Fc蛋白，发现其在蚕血淋巴中的表达量达到865 μg/mL，并且目的蛋白具有正确的结构；(3)核衣壳具有较大的柔韧性，最长可容纳100 kb的外源片段插入；(4)可以同时插入多个基因，表达多价蛋白[44]；(5)杆状病毒仅感染无脊椎类动物，在哺乳动物细胞中不会进行表达，因此对人畜不具有害性，用于制备疫苗安全可靠；(5)能够定位重组蛋白。
目前，家蚕/ BmNPV表达系统已成功表达多种人与动物的传染病病毒的保护性抗原基因，并制备成重组疫苗。此外，家蚕/ BmNPV表达系统还可作为研究蛋白质组学的工具。然而，家蚕/ BmNPV表达系统也存在一些缺点，比如外源蛋白在极晚期表达，可能导致加工不完全，无法进行连续性表达，机体释放出来的水解酶会降解重组蛋白，病毒的感染力不断衰弱等，而且蛋白的纯化和多元表达等方面的方法不够完善[45]。

体外基因表达系统包括原核细胞系统和真核细胞系统。原核细胞系统主要是大肠杆菌细胞系统，它操作简便，周期短，收益大，表达产物稳定，但是表达基因的分子量有限，不宜过大，且不能对表达产物进行一些翻译后加工作用。真核细胞系统包括COS 细胞、CHO细胞、酵母细胞和昆虫细胞等表达系统。昆虫细胞表达系统（即杆状病毒表达系统）独特的生物学特性，日益受到人们的重视。昆虫细胞培养及操作较简便，成本低，因此被广泛用于生产基因工程产品。本文就该系统的特性、技术方法以及应用新进展作一综述。