转基因动物的转移方法

把生物的基因转移到另一个生物体内，需要4个步骤，第1获得该基因，并且经过PCR技术来扩增该基因片段。第2步是基因表达载体的构建，需要把该目的性和一个载体结合起来，便于转入受体细胞内，这个结合的过程需要用到了基因的针线，一方面要切开DNA，另一方面还要把该基因片段和智力连接起来，所以我们选择了两种酶，前者呢叫限制酶，后者呢叫DNA连接酶。第3步是把这样的一个基因表达载体导入受体细胞内，导入的过程是受体细胞的种类而有区别，比如说植物细胞作为受体细胞的时候，可以使用农杆菌转化法，动物细胞作为受体细胞的时候使用基因枪法，而微生物作为受体细胞的时候呈采用钙离子处理的方法。第4步是否成功了呢？要对目的基因进行检测和鉴定。几个步骤完成以后操作成功。

遗传转化的方法按其是否需要通过组织培养、再生植株通常可分成两大类，第一类需要通过组织培养再生植株，常用的方法有农杆菌介导转化法、基因枪法；另一类方法不需要通过组织培养，比较成熟的主要有花粉管通道法，花粉管通道法是中国科学家提出的。农杆菌介导转化农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，自从技术瓶颈被打破之后，农杆菌介导转化在单子叶植物中也得到了广泛应用，其中水稻已经被当作模式植物进行研究。花粉管通道法在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。该方法于80年代初期由中国学者周光宇提出，中国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉管通道法培育出来的。该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握。 核显微注射法核显微注射法是动物转基因技术中最常用的方法。它是在显微镜下将外源基因注射到受精卵细胞的原核内，注射的外源基因与胚胎基因组融合，然后进行体外培养，最后移植到受体母畜子宫内发育，这样分娩的动物体内的每一个细胞都含有新的DNA片段。-这种方法的缺点是效率低、位置效应(外源基因插入位点随机性)造成的表达结果的不确定性、动物利用率低等，在反刍动物还存在着繁殖周期长，有较强的时间限制、需要大量的供体和受体动物等特点。详细步骤：在显微镜下，用一根极细的玻璃针（直径1-2微米）直接将DNA注射到胚胎的细胞核内，再把注射过DNA的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的幼仔。用这种方法生产的动物约有十分之一是整合外源基因的转基因动物。基因枪法利用火药爆炸或高压气体加速（这一加速设备被称为基因枪），将包裹了带目的基因的DNA溶液的高速微弹直接送入完整的植物组织和细胞中，然后通过细胞和组织培养技术，再生出植株，选出其中转基因阳性植株即为转基因植株。与农杆菌转化相比，基因枪法转化的一个主要优点是不受受体植物范围的限制。而且其载体质粒的构建也相对简单，因此也是转基因研究中应用较为广泛的一种方法。精子介导法精子介导的基因转移是把精子作适当处理后，使其具有携带外源基因的能力。然后，用携带有外源基因的精子给发情母畜授精。在母畜所生的后代中，就有一定比例的动物是整合外源基因的转基因动物。同显微注射方法相比，精子介导的基因转移有两个优点：首先是它的成本很低，只有显微注射法成本的1/10。其次，由于它不涉及对动物进行处理，因此，可以用生产牛群或羊群进行实验，以保证每次实验都能够获得成功。核移植转基因法体细胞核移植是一种转基因技术。该方法是先把外源基因与供体细胞在培养基中培养，使外源基因整合到供体细胞上，然后将供体细胞细胞核移植到受体细胞——去核卵母细胞，构成重建胚，再把其移植到假孕母体，待其妊娠、分娩，便可得到转基因的克隆动物。体细胞核移植法先在体外培养的体细胞中进行基因导入，筛选获得带转基因的细胞。然后，将带转基因体细胞核移植到去掉细胞核的卵细胞中，生产重构胚胎。重构胚胎经移植到母体中，产生的仔畜百分之百是转基因动物。

哺乳类动物基因转移方法，是将改建后的目的基因（或基因组片段）用显微注射等方法注入实验动物的受精卵（或着床前的胚胎细胞），然后将此受精卵（或着床前的胚胎细胞）再植入受体动物的输卵管（或子宫）中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物。
根据外源基因导入的方法和对象的不同，目前制作转基因动物的方法主要有显微注射法、反转录病毒法、胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞）法、电脉冲法、精子载体导入法等。 是最常用且成功率较高的方法，以转基因小鼠的制作为例，大致过程如下。
一、采集受精卵
（1）超数排卵：选取6～8周龄的雌性小鼠，先后腹腔注射5U孕马血清促性腺激素（pregnant mare serum gonactotropin，PMSG）和2.5～5.0U人绒毛膜促性腺激素(humar chorionic gonactotropin，HCG），以促进排卵，然后与鼠龄为12周～l年的雄性小鼠按1:1交配。交配成功的标志是在雌性小鼠的阴道口发现白色的阴道栓。
（2）取受精卵：与雄性小鼠合笼的次日上午，将确认有阴道栓的雌性小鼠用颈椎脱臼法剖杀，取出输卵管，置于培养液中，在体视显微镜下小心的切开输卵管膨大的壶腹部，用透明质酸酶溶液稍用力冲洗，使受精卵与输卵管分离，并流到培养液中，在体视显微镜下选择原核清晰的受精卵，移人装有培养液的胚胎培养皿中，然后在培养皿滴加矿物油使之覆盖在培养液表面，在CO2孵箱（37℃，5%CO2，95%空气）中培养5h左右（一般在上午10时左右取受精卵，培养至l3时可见雌、雄性原核，多数受精卵通常在13～18时之间原核形成并清晰可见）。
二、向受精卵雄性原核注入DNA溶液
受精卵中，有分别来自卵子和精子的两个原核，通常来自精子的雄性原核较大，能容纳更多的外源DNA，因此一般都是向雄性原核注入DNA溶液；另外，要导入的基因DNA还必须先用琼脂糖凝胶电泳法测定其纯度。将含有10～20个受精卵的培养液滴和DNA液滴共同滴放于载玻片上，然后固定在显微注射仪的载物台上，将视野中央调于DNA液滴上，右手持充满矿物油的玻璃吸管吸取DNA溶液，吸入量以DNA溶液和矿物油之问出现弯月形位置为准，然后再将视野中央移至受精卵液滴上，左手控制持卵吸管，利用负压将受精卵固定，并将右手的吸管尖端移至固定了的受精卵上，继而插入受精卵雄性原核，将DNA溶液注人雄性原核中，为肯定是否已注入，须用肉眼确定雄性原核是否膨大。仅将未损坏的完成操作的卵收集起来，在37℃的CO2孵箱中培养过夜，第2天将发育成2细胞的卵挑选出来。
三、将2细胞的受精卵移植到假妊娠雌性小鼠的输卵管中
用结扎了输精管的雄性小鼠与发情期的雌性小鼠（一般选用ICR小鼠）进行交配，虽然不能引起受精，但可以刺激子宫颈管，使雌性小鼠体内的黄体活化，造成能继续妊娠的内分泌环境，这种小鼠称为假孕雌性小鼠。将经显微注射的2细胞受精卵移植至交配第3天的假孕母鼠输卵管中，仍可正常发育。操作时，最好是在两侧输卵管各移植l2个卵，这样，情况良好时可得8只仔鼠，有时仅能产生1只仔鼠，因为DNA注入而造成的损伤可使许多受精卵在中途停止发育。
四、导入基因的鉴定
通常，胚胎移植生育出的全部仔鼠中，约有20%～30%具有导入基因，因此要用Southern Blot或PCR法对导入的遗传基因进行分析，以便挑选制作外源性基因导入成功的小鼠进行饲养和繁殖。
基因显微注射法的特点是外源基因的导入整合效率较高，不需载体，直接转移目的基因，目的基因的长度可达lOOkb(10万个碱基对）。它可直接获得纯系，所以实验周期短。但需要贵重精密仪器，技术操作难度大，并且外源基因的整合位点和整合的拷贝数都无法控制，易造成宿主动物基因组的插入突变，引起相应的性状改变，重则致死。
反转录病毒感染法
反转录病毒具有侵入宿主细胞并整合于细胞染色体DNA的能力。将外源基因DNA插入反转录病毒载体，通过辅助细胞包装成高感染度的病毒颗粒，感染胚胎后，将感染的桑椹期胚胎细胞导入子宫，可发育成携带外源基因的子代动物。
该法整合率较高，目的基因不易破坏，多是单拷贝、单位点整合，适合于难以观察到原核的禽类受精卵。由于病毒衣壳大小的限制，目的基因不宜超过10kb，否则影响活性和稳定。此外，病毒DNA可能影响外源基因在宿主动物的表达。 胚胎干细胞(ES细胞）是指从囊胚期的内细胞团中分离出来的尚未分化的胚胎细胞，具有发育全能性，能进行体外培养<；扩增、转化和制作遗传突变型等遗传操作。本法以整合有外源基因的ES细胞作为供体细胞，大致过程如下：
(1）获取发育至一定时期的胚胎，经培养后，剥离和分散内细胞团，再培养，最后分离、扩散、鉴定ES细胞。
(2）通过基因打靶技术，将外源基因经逆转录病毒感染、电脉冲法等方法导入ES细胞，体外培养和筛选有外源基因表达者。
(3）获取囊胚期胚胎，作为ES细胞的移植受体。
(4）通过显微操作将ES细胞注入到囊胚期胚胎的腔内，使之与内细胞团紧靠在一起，成为嵌合体。
(5）将注射过的胚胎，经培养后筛选无发育缺损的囊胚，移植到交配第3天的假孕受体动物子宫内，培育出转基因动物。本法外源基因整合率高，植入囊胚前筛选合适的转化的ES细胞，克服了以前只能在子代选择的缺点，并能充分利用分子生物学发展起来的各种先进方法，是很有前途的技术。缺点是不易建立ES细胞系。并且由于通过嵌合体途径，所以实验周期长。 一、发育生物学的研究
转基因动物可用于观察目的基因在胚胎不同发育阶段的特异性表达、关闭及调控机制，了解调控顺序（如增强子、启动子）在组织特异性表达中的作用，例如人肾素基因在小鼠体内的特异性表达可能与该基因的5’端侧翼顺序有关。此外，转基因动物还可用于识别动物发育过程中的基因（包括内源基因）及其活动，也可测出与动物发育相关的未知基因的表达特性。
二、遗传学研究
利用自然突变或人为修饰的基因作为外源基因，构建转基因动物，研究导人的异常基因的表型效应，可以了解基因站构和功能的盖系，还可用于基因组印迹分析、遗传缺陷的矫正等。 一、心血管疾病的研究
各种调节心血管功能的因子如转脂蛋白、转纤维蛋白溶酶原等都可通过转基因动物来了解其生理功能及作用，建立如动脉粥样硬化、突发性高血压、静脉闭塞等转基因动物模型。
二、肿瘤学研究
肿瘤基因的发现是近10年来肿瘤学研究的重大突破，现已发现乳腺癌基因等100多个肿瘤基因。实验证明，各种脊椎动物都携带肿瘤基因，在通常情况下并不引起细胞癌变，只有在某些条件下才能被激活使癌细胞增生而导致癌变。建立带有肿瘤基因的转基因动物可了解哪些组织对肿瘤基因转化活性敏感、肿瘤形成与其基因的关系、肿瘤基因生长分化影响等等。
三、遗传病研究
通常是将功能正常的外源基因导入动物体的靶细胞内，用来弥补缺陷的基因，改变患病细胞的遗传物质，进行基因治疗。相反的将显性疾病基因或一个、甚至多个外源基因人为地导入动物体内，就可制备遗传性疾病的转基因动物模型，研究和治疗人类遗传性疾病。例如亨廷顿(Hungtington）将舞蹈病基因导入小鼠，建立了舞蹈病动物模型，雷德黑得（Redhead）将正常小鼠的MBP（髓磷脂碱性蛋白）基因导入震颤小鼠，小鼠的震颤症状消失。
四、免疫学研究
巴宾耐特(Babinet）发现虽然转基因小鼠产生HBsAg，但在6个月内没有任何病理变化，表现为一种持续的带病毒状态。这些结果表明：乙型肝炎患者的肝细胞损伤不是由HBV的HBsAg表达直接引起，而是通过对肝细胞膜上的病毒抗原发生免疫反应造成的。因此，可以用转基因小鼠模型来研究免疫耐受与肝细胞损伤的关系以探讨发病机制。此外，转基因小鼠还为研究第l和第Ⅱ类主要组织相容性抗原的功能提供了新手段。 （1）小儿麻痹病毒受体转基因小鼠：把人的小儿麻痹病毒受体克隆并制作转基因小鼠。将小儿麻痹病毒的细胞性受体基因（human PVR gene）显微注射至C57BL/10小鼠的早期胚胎中，制作转基因小鼠并育成品系。这种小鼠表达人源的受体，有小儿麻痹病毒的感受性。而且感染了这种病毒的小鼠表现出和人一样的临床症状，对病毒株的特异性也表现出与人相同的性质。因此，这种小鼠除了是人的疾病模型之外，同时还可能替代猴子进行小儿麻痹病毒的效果、特异性等的检定，具有广泛的用途。
（2）乙型肝炎病毒携带者模型：乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）携带者的肝癌发生率为正常人的100~200倍，但尚缺乏有效的治疗方法。HBV只感染人或大猩猩，尚未研究出其他适宜的动物模型。通常认为，对HBV的免疫应答是受基因支配的，其免疫应答不充分者则成为慢性肝炎；肝癌的发生机制并不是单一的，由慢性肝炎的存在引起的肝细胞坏死和再生之问存在种种的遗传变异并出现癌变。HBV基因组是含有部分单链区的环状双链DNA分子，两条单链长度不一，长链为负链（3.2kb)，短链为正链，约为负链的50%～80%。因此，如果使l．2HB-BS的DNA成为两端重复的线状DNA用于转导，可实现全基因组的表达。另一方面，当仅要求HBS抗原表达时，仅需要导入1.2HB-BS基因即可。将添加了l.2HB-BS的HBV DNA导人C57BL/6J小鼠，在肝复制HBV，在血中释放病毒粒子。基因的表达在胚胎期发生，但对这些病毒抗原表现免疫宽容（钝化状态），不表现任何病理学变化，因此可作为人HBV携带者的模型。导人基因的小鼠与人一样，临床表现没有任何异常。
（3）乙型肝炎表面抗原转基因动物模型：将人乙型肝炎表面抗原（HBsAg）基因导入小鼠，可获得转HBsAg基因小鼠，而且该转基因小鼠的肝中可以产生HBsAg。这种转基因小鼠既可以模拟患者的带毒状态又不导致发病。奇萨利(Chisari）发现，HBsAg阳性的转基因小鼠用HBsAg加上福氏完全或不完全佐剂免疫，不能诱导产生特异性抗体，而HBsAg阴性的转基因小鼠则有应答反应，HBsAg阳性的转基因小鼠在6个月内未出现任何病理改变，却表现为持续的带毒状态。这些试验结果表明，乙型肝炎患者的肝细胞损伤不是由HBsAg表达直接引起的，而是通过对肝细胞膜上的病毒抗原发生免疫应答反应造成的。这种转基因小鼠模型可用来研究免疫应答耐受与肝细胞损伤的关系，探讨发病机制、持续带毒状态及其清除、药物筛选实验、HBV DNA在宿主内的复制、表达及调控与乙型肝炎发病的关系等有关HBV病理学和治疗学方面的难题。
除上述转基因小鼠动物模型的建立之外，尚有一些其他病毒性疾病的转基因小鼠动物模型也得以建立。如注射JC病毒基因组获得的转基因小鼠，可以用作多发性白质脑病（progressive multifocal leukoencephalopathy，PML）的转基因小鼠动物模型，利用人T淋巴细胞l型病毒（HTLV-1）的酪氨酸转氨酶（TAT）基因制备的转基因小鼠，可作为人神经纤维癯的疾病动物模型等。 哺乳类动物的DNA携有癌基因（oncogene），在理化或生物因子作用下被激活，引起细胞增殖、分化的调控失常以及与周围组织关系的紊乱，从而导致癌变。用癌基因或致癌病毒基因制作肿瘤转基因动物模型，可以探讨外来癌基因与实验动物的原癌基因（susceplible protooncogene）、癌基因表达与癌转化、癌基因表达与动物遗传背景或外界激活因素的关系。
通过向小鼠受精卵插入癌基因或原癌基因培育转基因小鼠，可在整体水平上研究癌基因对细胞正常分裂分化的影响，从而可以准确地研究癌基因与肿瘤形成的关系。例如，SV40T抗原基因是一个在转基因小鼠中得到广泛研究的转化基因。布林斯特（Brinster）等（1984）将T抗原序列与其自身的增强一启动子序列相连后导入小鼠，发现外源基因可在小鼠的中枢神经系统优先表达并引起脉络丛乳头状瘤。将T抗原序列与不同的启动子序列连接后的重组分子，导入小鼠后也能在启动子序列表达的组织引起肿瘤。这些组织分别是胰、肝、眼晶状体，甚至心肌组织等。
另外，像病毒癌基因、细胞原癌基因与不同启动子连接后，也被导入小鼠并获得转基因动物。如将C-myc癌基因置于小鼠乳腺肿瘤病毒（mMTV）基因启动子的调节下，获得了转基因小鼠。这些小鼠在胸部、睾丸和淋巴组织等部位都可引起肿瘤。这些试验结果表明，原癌基因的异常调节有使组织易于恶化的倾向。上述转SV40T抗原基因和c-myc基因小鼠的研究结果有力地支持了肿瘤多步发生的假说，即肿瘤的发生至少需要二次转化。如转T抗原和c—myc基因在各个器官都得以表达，但只在少数几个器官发生癌变。 （1）高歇（Gaucher）病转基因动物模型Gaucher病是葡萄糖苷酶缺损（溶酶体酶的一种）引起内脏葡萄糖脑苷脂积蓄的代谢病。依临床症状可分为3种类型，其中，成人型（1型）和亚急性青年型（Ⅲ型）发生肝脾肿大或贫血、骨质疏松，急性婴儿型（Ⅱ型）则表现痉挛等中枢神经症状。各型的肝、脾、淋巴结、骨髓等出现Gaueher细胞（含有葡萄糖脑苷脂的巨噬细胞）。已报道了自发裸鼠和实验诱发模型，但在治疗等方面的研究还不充分。
改造小鼠的β-葡萄糖苷酶基因，并以此为基础进行基因打靶。在外显子9和外显子10之间构筑具新青霉素磷酸转移酶抗性基因(neor）或在3’端构筑具有HSV-tk的靶载体（targeting vector），在ES细胞中实施PNS（正负选择法）选择。其后，对嵌合小鼠进行品系化培育，分析纯合子或杂合子。与正常个体的β-葡萄糖苷酶活性相比，杂合子为44%，纯合子为4%。纯合子中表现了p葡萄糖脑苷脂的积蓄。纯合子个体大小正常或比杂合子明显小，呈现呼吸困难、发绀。这样的个体不被母鼠饲养，全部都在24h内死亡。病理显示肝、骨髓、脑、脾的巨噬细胞溶酶体内脂肪积累，和人的病理改变相同，只是这种小鼠的肝，在胎儿早期可以见到血细胞的分化图像，虽然巨噬细胞溶酶体中有脂肪积蓄，但是急死的情况并不多见。可以认为，与Gaucher病Ⅱ型的小儿患者所见的急性神经症状是一致的。
该模型是现有转基因疾病动物模型中评价最高且已得到应用的基因模型之一。
（2）FAP转基因小鼠
家族性神经多发性淀粉样变（familial amyloidotic polyneuropathy，FAP）是常染色体显性遗传的疾病，发生全身的细胞外淀粉样蛋白沉着，是以末梢神经和自主神经损害为主的疾病。淀粉样蛋白的主要成分发生变异，患者大部分是第30位缬氨酸置换为蛋氨酸，已证明是变异氨基酸所对应基因的碱基出现置换。因此，从病因上讲，它是蛋白质变异直接导致淀粉样蛋白沉着的疾病。构建带有金属硫蛋白基因MT启动子的变异淀粉样蛋白基因并用转基因方法整合到C57BL/6J小鼠，对该转基因小鼠的分析结果表明，变异淀粉样蛋白基因表达从胚胎期就可见到，而变异淀粉样蛋白沉着则发生于青春期，以后随着年龄的增加沉着量逐渐加大。
但是，该病在人的末梢神经或自主神经出现淀粉样蛋白沉着，而在转基因小鼠中则不出现。这是否由于小鼠与人的组织学特征存在差异，目前尚不清楚。由于这一原因，转基因小鼠不出现临床症状。
从这些小鼠的分析已经清楚了解下面4点：①由tranethyretin分子组成的四聚复合体在血中的变化对淀粉样蛋白的沉着是重要的；②淀粉样蛋白中的微小成分即血清淀粉样蛋白P成分不对淀粉样蛋白沉着的开始、伸展、组织分布带来任何影响；③各组织的微小环境，即血流量丰富度、组织密度对淀粉样蛋白沉着量有较大的影响；④小鼠的饲育环境影响淀粉样蛋白的沉着。该转基因小鼠的关键问题是，末梢神经和自主神经并不发生淀粉样蛋白沉着。阐明这一问题对今后开发治疗方法将是重要的。
目前，转基因疾病动物模型的研究大部分局限予单个基因的转移。而生物学功能的表现以及疾病的发生通常是基因与基因之间相互作用的结果，故研究导致疾病和中医证型的功能基因组，利用转基因技术制作功能基因组动物模型更有意义。功能基因组动物模型的开发将随着人类基因组计划的完成而逐步得以实现。

转基因动物:将重组基因转染整合到动物受体